本发明专利技术公开了一种高通量的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法及其检测试剂盒，其定量检测法包括步骤：A、对于非临床样品，其检测步骤，包括Hep2细胞的培养阶段、RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤；B、对于临床或临床前样品，其检测步骤，包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤；所述定量检测试剂盒包括：RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA检测试剂。本发明专利技术改变了目前筛选抗病毒药物的方法，提高了筛选通量，缩短了筛选周期，可以节约60％以上的时间。同时也用于大量临床或非临床样品中RSV的高通量定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种病毒滴度的定量检测法，特别是涉及一种用于药物筛选及生物样品检验的RSV(Respiratory Syncytial Virus,呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法及其高通量检测试剂盒。
技术介绍
呼吸道合胞病毒(RSV)是在婴儿时期和儿童早期导致支气管炎和肺炎的主要原因。该病毒通常会引起再感染。再感染一般发生在成年人中。在老人和缺乏免疫力的病人当中，可能导致下呼吸道的严重疾病。通常病情会持续两到三周.在婴儿和有高风险病情的儿童中，RSV(呼吸道合胞病毒)感染可能会危及患者的生命。病毒性支气管炎是一个严重的传染病，据估计每年引起100万人死亡，其中大多数病例是由RSV(呼吸道合胞病毒)引起的。出生后第一年，高达70% 80%比例的婴儿将感染RSV (呼吸道合胞病毒)。目前尚无有效的疫苗或小分子药物用来防治RSV(呼吸道合胞病毒)感染。因此，用快速、高效的方法来筛选获得抗RSV(呼吸道合胞病毒)的有效药物是研发新药的有效手段。在抗病毒药物筛选方法中，目前主要使用细胞病变效应(CPE)法。其检测方法有四甲基偶氮唑盐(以下简称MTT)法，或者使用Cell Counting Kit_8 (CCK-8试剂盒)进行检测。其中，MTT法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。而CCK-8试剂盒是基于WST-8 [2-(2-甲氧基-4-硝苯基)`-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐的检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系，即生成的甲臜量与活细胞数量成正比。但这些CPE法灵敏度低，通量亦不适于大量化合物的筛选。酶联免疫吸附试验(ELISA)是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测抗原，后者用于测定特异性抗体。ELISA是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，具有适宜于大规模筛查试验、又可以用于少量标本的检测、既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，因此，具有广泛的使用价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种用于高通量药物筛选及生物样品检验的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法及其检测试剂盒。本专利技术改变了目前筛选抗病毒药物的方法，提高了筛选通量，缩短了筛选周期(可以缩短60%以上的时间)，同时该方法也用于临床或非临床样品的定量检测。为解决上述技术问题，本专利技术的用于高通量药物筛选及生物样品检验的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法，包括步骤A、对于非临床样品，其检测步骤，包括H印2细胞的培养阶段、RSV (呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤；B、对于临床或临床前样品，其检测步骤，包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤。所述非临床样品包括化合物；临床样品包括患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液；临床前样品包括动物模型组织提取物等。所述A中的H印2细胞的培养阶段，步骤包括①将Ifep2细胞接种至细胞培养板中培养；其中，培养条件为37°C、5% CO2、培养16-24小时；②待检测样品(非临床样品，如化合物)加入上述接种有细胞的培养板中；③加入RSV (呼吸道合胞病毒)至上述培养板中；④培养板经培养96-120小时后，取细胞培养上清进行ELISA检测。所述细胞培养板是384孔培养板，接种的细胞密度控制在每孔1800-3000个细胞，体积为20-50 μ I ； 所述培养阶段③中，加入RSV (呼吸道合胞病毒)的量为50-150倍TCID5tl (Tissueculture infective dose,半数组织培养感染剂量)病毒稀释液,体积为10_40ul。所述A、B中的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA检测阶段，步骤包括①在384孔酶标板内加入羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗体，经孵育、洗涤后，加入封闭试剂作用，然后洗涤；②在384孔酶标板内加入待测样品(包括细胞培养上清，临床或临床前样品)经孵育、洗涤后，加入生物素结合羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗体，经孵育、洗涤；③在384孔酶标板内加入抗生物素过氧化蛋白酶，经孵育、洗涤后，加入TMB(3，3' ,5,5' -Tetramethylbenzidine,四甲基联苯胺)显色液作用后，再加入TMB终止液；④在450nm波长处测量酶标板的吸光值。所述ELISA检测阶段中，所涉及的所有洗涤是使用PBS-Tween 20 (PBST)洗涤3次以上。所述ELISA检测阶段的步骤①中，羊抗RSV多克隆抗体加入量为羊抗RSV多克隆抗体(ViroStat-0601)的I 480-1 2000倍的稀释液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的条件为37°C孵育1-3小时；封闭试剂为O. 5% -2%的BSA(牛血清白蛋白)，加入量为每孔100-120μ 1，4°C过夜或者37°C孵育2-4小时。所述ELISA检测阶段的步骤②中，待测样品的加入量为10-50 μ I (样品或样品稀释液)，待测样品孵育的条件为25°C过夜或者37°C孵育1-3小时；生物素结合羊抗RSV多克隆抗体的加入量为生物素结合羊抗RSV多克隆抗体(ViroStat-0607)的I 2000-1 10000倍的稀释液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的条件为37°C孵育1-3小时。所述ELISA检测阶段的步骤③中，抗生物素过氧化蛋白酶的加入量为抗生物素过氧化蛋白酶(Sigma-E2886)的I 1000-1 4000倍的稀释液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的条件为37°C孵育20-40分钟；TMB显色液(Sigma_T0440)的加入量为每孔30-60 μ 1，常温作用2-15分钟；ΤΜΒ终止液(TMB底物终止液，Sigma_S5814)加入量为每孔30-60 μ I。另外，本专利技术还公开了一种RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测试剂盒，可应用于药物筛选及生物样品检验。该定量检测试剂盒包括=RSV蛋白含量的ELISA检测试剂，还可包括384孔酶标板。其中，RSV蛋白含量的ELISA检测试剂包括羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗体、生物素结合羊抗RSV (呼吸道合胞病毒)多克隆抗体、抗生物素过氧化蛋白酶、封闭试齐U、洗涤液、TMB显色液、TMB终止液。所述定量检测试剂盒，还包括H印2细胞、RSV (呼吸道合胞病毒)。所述定量检测试剂盒的检测步骤按照如上所述的步骤进行。本专利技术通过运用酶联免疫吸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于高通量药物筛选及生物样品检验的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的定量检测法，包括步骤：A、对于非临床样品，其检测步骤，包括Hep2细胞的培养阶段、呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤；B、对于临床或临床前样品，其检测步骤，包括呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤。
【技术特征摘要】
1.一种用于高通量药物筛选及生物样品检验的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的定量检测法，包括步骤 A、对于非临床样品，其检测步骤，包括Ifep2细胞的培养阶段、呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤； B、对于临床或临床前样品，其检测步骤，包括呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤。2.如权利要求1所述的定量检测法，其特征在于所述非临床样品包括化合物； 临床样品包括患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液； 临床前样品包括动物模型组织提取物。3.如权利要求1所述的定量检测法，其特征在于所述A中的H印2细胞的培养阶段，步骤包括 ①将H印2细胞接种至细胞培养板中培养；其中，培养条件为37°C、5%CO2、培养16-24小时； ②将非临床样品加入上述接种有细胞的培养板中； ③加入呼吸道合胞病毒RSV至上述培养板中； ④培养板经培养96-120小时后，取细胞培养上清进行ELISA检测。4.如权利要求3所述的定量检测法，其特征在于所述细胞培养板是384孔培养板，接种的细胞密度控制在每孔1800-3000个细胞，体积为20-50 μ I ； 所述培养阶段③中，加入呼吸道合胞病毒RSV的量为50-150倍TCID5tl病毒稀释液，体积为 10_40 u I ο5.如权利要求1所述的定量检测法，其特征在于所述Α、B中的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA检测阶段，步骤包括 ①在384孔酶标板内加入羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体，经孵育、洗涤后，加入封闭试剂作用，然后洗涤； ②在384孔酶标板内加入待测样品经孵育、洗涤后，加入生物素结合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体，经孵育、洗涤； ③在384孔酶标板内加入抗生物素过氧化蛋白酶，经孵育、洗涤后，加入TMB显色液作用后，再加入TMB终止液； ④在450nm波长处测量酶标板的吸光值。6.如权利要求5所述的定量检测法，其特征在于所述ELISA检测阶段中，所涉及的...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭祥翔，李少华，陆恒，
申请(专利权)人：上海药明康德新药开发有限公司，苏州药明康德新药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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