一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法。一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，包括：（1）同时固定有若干种特异性抗体的芯片，所述特异性抗体能够与肺癌标志物发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述芯片底膜上形成若干个独立识别位点；（2）反应剂和检测剂，用于通过TRFIA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。本发明专利技术的试剂盒和方法可同时检测NSE、SCC、CEA、CA19-9、CYFRA21-1和pro-GRP六项指标，提高检测的准确率，减少重复的实验步骤，节省时间和成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及ー种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法。
技术介绍
生物芯片技术是近十几年兴起的生物技木，因其在一次反应中可以平行分析多种信息，迅速在诸多生物学领域得到应用。生物芯片技术按检测对象分类，主要分为基因芯片和蛋白质芯片两类。蛋白质芯片是ー种前沿技木，它通过固定于支持介质上的多种蛋白质构成的微阵列，直接检测特定功能物质。现有的检测尿液、血清及其他体液的方法，ELISA、放射性同位素标记、金标、荧光、化学发光、时间分辨荧光等，大多是单指标检测，信息量少。与传统的检测方式相比，蛋白质芯片技术具有如下优点1、高通量，同时可进行多祥本的检测；2、所需样本量小；3、节省试剂、时间、人工等，节省成本。肺癌目前是全世界癌症死因的第一名。1995年全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在上升，2003年世界卫生组织(WHO)公布的死亡率是110万/年，发病率是120万/年。而女性患肺癌的发生率尤其有上升的趋势。本病多在40岁以上发病，发病年龄高峰在60 79岁之间。男女患病率为2.3:1。另外种族、家属史与吸烟对肺癌的发病均有影响。目前检测肺癌的标志物有SCC (鳞状细胞癌相关抗原)、CEA (癌胚抗原)、CA 19-9(糖类抗原)、CYFRA21-1(细胞角蛋白19片段)、NSE (神经元特异性烯醇化酶)、pro_GRP (胃泌素释放肽前体)，每种标志物诊断肺癌的特异性和敏感度都不够高，综合这六种指标诊断肺癌能提高诊断的特异性和敏感度，但目前临床上使用的都是检测单项指标的产品。
技术实现思路
本专利技术的目的提供ー种蛋白质芯片试剂盒，该试剂盒把多项指标综合在同一反应下測定，提高检测效率，同时提高检测的特异性和敏感度。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是ー种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，包括(I)同时固定有若干种特异性抗体的芯片，所述特异性抗体能够与肺癌标志物发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述芯片底膜形成成若干个独立识别位点；(2)反应剂和检测剂，用于通过TRFIA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。所述特异性抗体是分别针对如下肺癌标志物的抗体鱗状细胞癌相关抗原(SCC)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA19-9)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE )、胃泌素释放肽前体(pro-GRP )。所述反应剂为抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合液，且所述特异性抗体标记有生物素。所述检测剂为用于识别生物素标记的链霉亲和素(streptavidin, SA),所述链霉亲和素标记有铕元素。所述的芯片底膜为硝酸纤维素膜。本专利技术的另ー个目的是提供ー种综合检测肺癌标志物的方法，具体步骤为(I)、把制备好的芯片用双面胶粘帖到聚苯こ烯小杯的底部；(2)、把100微升样本血清、100微升质控品混合液分别加入不同的上述小杯中，37度，震荡，温育I小时；洗涤液洗涤6次；(3)、加入反应剂100微升，37度，震荡，温育I小时；洗涤液洗涤6次；(4)、加入90微升稀释液和10微升检测剂，37度，震荡，温育20分钟；洗涤液洗涤6次；(5)、用冷空气吹干或离心甩干；(6)、用时间分辨突光扫描仪测量发光值；(7)、各标志物根据各自的标准品的系列浓度的发光值为Y轴、标准品浓度为X轴做标准曲线，由测量的样本血清的发光值根据不同标志物的标准曲线计算出各标志物的含量。所述的质控品是 SCC、CEA、CA 19-9, NSE、CYFRA21-1 和 pro-GRP 的标准品。本专利技术的综合检测肺癌的蛋白质芯片试剂盒和方法可同时检测NSE、SCC、CEA、CA19-9.CYFRA21-1和pro-GRP六项指标。将肺癌六项指标纳入同一试剂盒中检测，降低了不同产品、不同实验条件下产生的检测误差；在同一实验条件下，同时检测肺癌六项指标，提闻检测的准确率，减少重复的的实验步骤，节省时间和成本。附图说明图1为本专利技术检测肺癌标记物的蛋白质芯片试剂盒的芯片点样示意图；图2为本专利技术蛋白芯片试剂盒检测肺癌病人血样结果的示意图。具体实施例方式实施例1本专利技术的ー种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒的制备一、芯片的制作1、把孔径为0. 2微米的硝酸纤维素膜(Bio-Rad公司生产)剪成的小块；2、配制包被缓冲液PH7. 8的50mM/L的Tri s—Hcl缓冲液；用包被缓冲液分别把抗 NSE 抗体 10-7938(Fitzgerald 公司)、抗 pro-GRP 抗体 H00002922_M03(Abnova 公司)、抗CA 19-9 抗体 ab3982 (Abeam 公司)、抗 CEA 抗体 MAM02-008 (Meridian 公司)、抗 CYFRA21-1抗体M01300M (Meridian公司)、抗SCC抗体H00006317M01 (Abnova公司)、人血清白蛋白(阴性对照)按照0. 7 - 4mg/L的浓度稀释成溶液；3、点膜用BioDot公司的BiojetPlus点样系统将步骤2中稀释好的抗体溶液按照0.1 2微升/点分别点样到已剪好的硝酸纤维素膜上，56点/平方厘米，点阵排布如图1所示；4、封闭把点样后的硝酸纤维素膜用封闭液封闭2小时；封闭液姆升50m M/LPH7. 4的磷酸盐缓冲液中包含5%的BSA，5%的海藻糖，0. 2%的Tween20，0. 5%的叠氮钠；5、把封闭后的硝酸纤维素膜用蒸馏水洗涤10次，2 6度保存备用。ニ、反应剂的制备将标记有生物素的抗NSE抗体10-7936、抗pro-GRP抗体PAB4986、抗CA19-9抗体abll6024、抗 CEA 抗体 MAM02-88、抗 CYFRA21-1 抗体、抗 SCC 抗体 H00025816-A01 用稀释液(稀释液配方为50mM/L PH7. 8的Tris缓冲液，包含50克/升的BSA，ImM/L的叠氮钠)稀释成抗体混合液，备用；三、检测剂的制备1、把5 10毫克的聚こ烯胺盐(PVA)溶入800微升0. 05M/L的PH9.1碳酸盐缓冲液中；2、把500 1000微克的超长臂生物素硫代琥珀酰亚胺酷(NHS - LC - LC - Biotin)溶入80微升的0. 05M/L的PH9.1碳酸盐缓冲液中；3、把上述的步骤I和2的两种溶液混合，室温放置2小时；4、称取10 20毫克4，7 - ニ苯氯磺基_ 1，10邻菲啰啉_ ニ羧酸(BCPDA)，加入步骤3的混合液中，用0. 05M/L的PH9.1碳酸盐缓冲液调整体积至4毫升，室温剧烈摇动3 4小时，至溶液澄清；5、把步骤4中的澄清溶液转入到截留分子量为12000的透析袋中，放入5升0.1M/L的NaHC03溶液中，磁力搅拌过夜；更换透析液重复3次；6、把步骤5中的透析后的溶液加入到截留分子量为30000的离心浓缩管中，把溶液的体积浓缩至0. 4 0 . 6毫升；然后把浓缩液注射入HPLC中，用TSK - 250硅凝胶分子筛柱，在0. 5毫升/分钟的流速、0. 05M/L PH8. 0的Tris缓冲液为流动相的条件下过柱，在325nm的最大吸收峰处收集组分，约得到收集液4毫升；7、在步骤6中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，其特征在于包括：（1）同时固定有若干种特异性抗体的芯片，所述特异性抗体能够与肺癌标志物发生抗体?抗原反应，每种特异性抗体分别固定于芯片底膜上，形成若干个独立识别位点；（2）反应剂和检测剂，用于通过TRFIA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体?抗原反应的物质。

【技术特征摘要】
1.一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，其特征在于包括(I)同时固定有若干种特异性抗体的芯片，所述特异性抗体能够与肺癌标志物发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于芯片底膜上，形成若干个独立识别位点；(2)反应剂和检测剂，用于通过TRFIA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性抗体是分别针对如下肺癌标志物的特异性抗体鳞状细胞癌相关抗原、癌胚抗原、糖类抗原、细胞角蛋白19片段、神经元特异性烯醇化酶和胃泌素释放肽前体。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述反应剂为抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合液，且所述特异性抗体标记有生物素。4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述检测剂包含用于识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：王嘎，程自卿，
申请(专利权)人：河南生生医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：