肿瘤标志物LIMK1及其应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤标志物LIMK1及其应用，更具体的涉及LIMK1基因及其表达产物在诊治骨肉瘤中的应用。本发明专利技术通过荧光定量PCR技术检测骨肉瘤细胞及患者组织，显示LIMK1基因过表达。进一步，设计多组siRNA，沉默LIMK1基因表达。本发明专利技术一方面为研究骨肉瘤提供新思路，另一方面为在基因水平诊治骨肉瘤提供了潜在的新靶点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤标志物LIMK1及其应用，更具体的涉及LIMK1基因及其表达产物在诊治骨肉瘤中的应用。本专利技术通过荧光定量PCR技术检测骨肉瘤细胞及患者组织，显示LIMK1基因过表达。进一步，设计多组siRNA，沉默LIMK1基因表达。本专利技术一方面为研究骨肉瘤提供新思路，另一方面为在基因水平诊治骨肉瘤提供了潜在的新靶点。
技术介绍
骨肉瘤是一种临床常见的成骨性恶性肿瘤，约占所有骨肿瘤的20％。其恶性程度高，好发于青少年，易复发和转移，预后较差。随着分子生物学理论和技术水平的提高，尤其是肿瘤分子生物学的发展，骨肉瘤的发生机制在分子水平有了一定的认识。骨肉瘤中e-myc、e-ras、e-fos等癌基因以及p53、Rb、pl6等抑癌基因的异常表达，为骨肉瘤的基因治疗提供了靶向基因选择的理论基础。而基因治疗要想取得突破性的进展，有赖于发现更多更有效的靶点，寻找更具有针对性的新的目的基因。近年来，有关骨肉瘤基因治疗的研究在基因治疗方法、基因载体、载体导入途径和靶向调控等方面取得了一些进展，基因治疗有望成为一种治疗骨肉瘤较理想的方法。LIM激酶(LIMK)是LIM蛋白家族成员之一，是细胞骨架动力学的重要调节元素。主要作用是参与细胞骨架的重组，具有广泛的生物学效应。迄今为止，在哺乳动物中已发现两种LIM激酶，LIMK1和LIMK2，它们的氨基酸序列有50％的同源性。在结构上它们都是由两个N末端的LIM结构域与C末端的激酶结构域连接而成。LIMK1穿梭于细胞质与细胞核之间，它在细胞核中的作用尚不清楚，细胞质中的LIMK1主要是在含肌动蛋白的细胞骨架的组装中起作用。LIMK1可以使底物cofilin磷酸化，从而逆转cofilin诱导的肌动蛋白解聚。肌动蛋白细胞骨架的动力机制在肿瘤发生中的作用不容置疑，因而LIMK1作为肌动蛋白细胞骨架的重要上游调控子在癌症防治中的意义值得探讨。近年来，LIMK1作为肿瘤新的研究热点正受到广泛的关注，有研究报告证明LIMK1在前列腺癌、乳癌等恶性肿瘤的细胞及组织中过表达、活性增强，相关研究发现前列腺癌中与转移相关的染色体基因位点在7ql1.2，而人类LIMK1基因定位在7ql1.23，提示两者具有相关性；但并没有揭示其与骨肉瘤的相关性。在研究LIMK1介导的信号通路逆转肿瘤侵袭的过程中，通过RT-PCR检测等实验证实了人成骨肉瘤细胞及组织中LIMK1基因过表达；有效沉默LIMK1基因表达，能明显降低骨肉瘤细胞的侵袭能力。本专利技术提供了一种针对骨肉瘤的诊治靶点，具有重要的临床应用意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种骨肉瘤诊断制剂，所述骨肉瘤诊断制剂通过检测LIMK1基因和/或LIMK1基因表达产物的表达量，可以判断受试者是否患有骨肉瘤。本专利技术所述LIMK1诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、免疫方法检测骨肉瘤组织或细胞中LIMK1基因的表达和/或LIMK1基因表达产物的表达量。所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增LIMK1基因的引物。扩增LIMK1基因的正向引物序列为SEQIDNO.1，反向引物序列为SEQIDNO.2；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为SEQIDNO.3，反向引物序列为SEQIDNO.4。进一步，该RCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。进一步，所述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。所述试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选TRIZOLRReagent进行RNA样本提取。进一步，应用免疫方法检测骨肉瘤细胞和/或组织中LIMK1基因的表达产物。所述免疫检测方法检测骨肉瘤中LIMK1蛋白表达为免疫沉降/免疫印迹技术和/或ELISA和/或胶体金检测方法。优选的，所述免疫方法为蛋白免疫沉淀和免疫印迹技术。所述免疫技术中的抗体可采用市售的LIMK1单克隆抗体。本专利技术的目的是提供了一种骨肉瘤检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测LIMK1蛋白，进一步，所述试剂盒还包括其他试剂。本专利技术的目的在于提供一种治疗骨肉瘤的制剂，所述制剂中含有抑制LIMK1基因的转录或表达的试剂或化合物。进一步，所述治疗骨肉瘤的制剂中含有激活LIMK1的抑制基因、激活抑制LIMK1表达的蛋白、导入抑制LIMK1转录或表达的siRNA、激活促进LIMK1mRNA降解的microRNA。优选的，所述治疗骨肉瘤的制剂含有抑制LIMK1基因转录或表达的siRNA。优选的，针对抑制LIMK1基因的转录或表达的siRNA选自下列一组或几组siRNA：SEQIDNO.5和SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10。更优选的，所述治疗骨肉瘤的制剂含有siRNA序列为SEQIDNO.9和SEQIDNO.10。RNA干涉(RNAi)是1998年发现的沉默基因表达的新技术。RNAi是指由短双链RNA诱导的同源RNA的降解。如果被降解的是细胞内的mRNA，可以抑制相应的基因表达，使细胞出现特定基因缺失表型；如果被降解的是病毒RNA，可以抑制病毒的复制。RNAi是一种广泛的体外基因失活的适用方法，是研究基因功能公认的一种有效工具，可以用于药物靶点筛选，并可能产生基于RNAi的治疗手段，用于治疗肿瘤、病毒感染等疾病。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过硫酸钙共沉淀法、电穿孔法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。本专利技术的目的在于提供上述治疗骨肉瘤的制剂在制备骨肉瘤治疗药物或试剂中的应用。为了实现上述目的，本专利技术通过分子细胞生物学方法验证了LIMK1基因与骨肉瘤的关系：LIMK1在骨肉瘤细胞及组织中过表达，与骨肉瘤具有很好的相关性，可用于制备骨肉瘤治疗制剂，具有重要的临床应用价值。本专利技术的目的在于提供一种骨肉瘤抑制试剂，所述骨肉瘤抑制剂抑制LIMK1基因的表达，进一步，所述的骨肉瘤抑制试剂中含有抑制LIMK1基因表达的siRNA。本专利技术的优点和有益效果在于：(1)本专利技术首次公开了LIMK1基因表达与骨肉瘤相关，LIMK1基因有望成为诊断骨肉瘤的分子标志物，并为研究骨肉瘤发生、发展的分子机理提供新的思路。(2)应用siRNA技术可以有效沉默LIMK1基因表达，能明显降低骨肉瘤细胞的侵袭能力。本专利技术提供了一种针对骨肉瘤的分子水平的治疗靶点，具有重要的临床应用意义。附图说明图1是LIMK1在骨肉瘤细胞(U2OS、MG63)及人成骨细胞(hFOB)中的相对表达量图。图2是LIMK1在骨肉瘤组织及癌旁组织中的相对表达量图。图3是RNA干扰后各组LIMK1mRNA相对表达水平图；C1组，空白对照组；C2组，转染脂质体组；C3组，转染空载体组；S1，S2，S3组：转染特异性siRNA组。图4是Boyden小室检测人成骨肉瘤细胞的侵袭能力激光共聚焦观测结果图。具体实施方式实施例1：验证LIMK1在骨肉瘤细胞中的表达为了验证LIMK1在骨肉瘤细胞的表达及特性，常规培养了2种人成骨肉瘤细胞，收集各组细胞样本，同时收集人成骨细胞hFOB细胞样本做为对照组，采用荧光实时定量P本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测LIMK1基因和/或LIMK1蛋白表达的制剂在制备骨肉瘤诊断制剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.检测LIMK1基因和/或LIMK1蛋白表达的制剂在制备骨肉瘤诊断制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：诊断制剂检测骨肉瘤MG63及U2OS中LIMK1基因和/或LIMK1蛋白的表达。3.根据权利要求1-2所述的应用，其特征在于，骨肉瘤的诊断制剂采用荧光定量PCR检测技术检测LIMK1基因表达。4.根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于，应用荧光定量PCR检测法检测骨肉瘤中LIMK1基因的产品含有一对特异性扩增LIMK1基因的引物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述一对特异性扩增LIMK1基因的引物上游引物序列为SEQIDNO.1，下游引物序列为SEQIDNO.2。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，骨肉瘤的诊断制剂包括用免疫方法检测LIMK1蛋白的表达。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，免疫方法检测LIMK1蛋白表达的为免疫沉淀/免疫印迹技术和/或ELISA检测试剂盒和/或胶体金检测试剂盒。进一步，所述免疫技术中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王岩，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22