一种头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒，包括色谱仪、二极管阵列检测器、色谱柱、漩涡混合器、电热恒温水浴锅、离心机、分析天平、匀浆机、氮气吹干仪和双重水蒸馏器、头孢噻呋标准品、乙腈、甲醇为色谱纯、二硫赤藓醇（纯度99%）、碘乙酰胺（纯度99%）、三氟乙酸和四硼酸钠等。本发明专利技术也建立了用高效液相色谱技术测定代谢物中头孢噻呋残留的方法，代谢物样品经二硫赤藓醇提取，碘乙酰胺衍生，C18固相柱萃取净化，甲醇溶液洗脱，结果表明，该方法操作简便、快速、灵敏度高。

Cephalosporin metabolite detection method and kit

The invention discloses a ceftiofur metabolite detection method and kit, including chromatography, diode array detector, column, vortex mixer, electric thermostatic water bath, centrifuge, analytical balance, homogenate machine, nitrogen concentration and double water distiller, ceftiofur, acetonitrile and methanol as standard chromatographic purity, two sulfur erythritol (purity 99%), iodoacetamide (purity 99%), three fluorine acetic acid and four sodium borate etc.. The present invention also established method for the determination of residues of ceftiofur metabolites in technology by HPLC, the samples were two sulfur metabolites of erythritol extract, iodoacetamide derivative, C18 solid phase extraction column purification, methanol elution, results show that the method is simple, rapid, high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒。
技术介绍
本品为类白色至淡黄色粉末。在水中不溶，在丙酮中微溶，在乙醇中几乎不溶。为抗微生物药。头孢菌素类为半合成的第三代动物专用头孢菌素。制成钠盐和盐酸盐供注射用。本品肌内和皮下注射后吸收迅速，血中和组织中药物浓度高，有效血药浓度维持时间长，消除缓慢，半衰期长。给牛，猪肌内注射本品后，15MIN内迅速被吸收在血浆内生成一级代谢物脱呋喃甲酰头孢噻呋（Desfuroylceftiofur,DFC）.由于内酰胺环未受破坏，其抗菌活性与头孢噻呋基本相同。DFC在组织内可进一步形成无活性的DFC半胱胺酸二流化物。本品的表观分布容积≤1L/KG。猪，绵羊，牛多剂量肌内注射后在肾中浓度最高，其次为肺，肝，脂肪和肌肉，一般可维持高于MIC的浓度。例如猪按3mg/kg肌内注射，一日1次，连用3天，其组织浓度分别为：血浆3.25，呼吸道0.60，皮肤0.57，肺0.49，扁桃体0.30，关节液0.29。牛按1mg/kg肌内注射，一日1次，连用5天，其组织浓度分别为血浆1.0（注射后7.5H）关节液0.65（注射后2.5H），肺0.36，空肠0.34。在奶中主要以无活性的游离代谢物-DFC半胱胺酸二硫化物的形成出现。头孢塞呋排泄较缓慢，动物的半衰期有明显的种属差异（马，牛，绵羊，猪，犬，鸡，火鸡的T1/2）分别为3.15，7.12，2.83，14.5，4.12，6.77和7.45H。但大部分可在肌内注射后24H内由尿和粪中排出。DFC在牛，猪和鸡的粪便中迅速降解为无活性化合物，所以需要一种头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒，具有多种数据综合监测特点，解决现有动物代谢物检测头孢噻呋的问题。本专利技术提供如下技术方案：一种头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒，包括色谱仪、二极管阵列检测器、色谱柱、漩涡混合器、电热恒温水浴锅、离心机、分析天平、匀浆机、氮气吹干仪和双重水蒸馏器、头孢噻呋标准品、乙腈、甲醇为色谱纯、二硫赤藓醇（纯度99%）、碘乙酰胺（纯度99%）、三氟乙酸和四硼酸钠等，其特征在于：该头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒检测步骤为：S1、配制主要溶液，主要溶液包括标准储备液、标准工作液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、二硫赤藓醇提取液、碘乙酰胺溶液和流动相；S2、待检测物和设备检测前准备，包括：（1）全价不含抗菌药物的饲料，全价饲料连续喂养十天的动物，之后收集动物代谢物备用，（2）色谱柱：AgilentZorbaxXDB－C18（4.6m×250mm×5μm，I.D），（3）检测器：紫外检测器，检测波长266nm；（4）流动相为水：三氟乙酸∶乙腈=800∶1∶200（体积比）；（5）柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：100μL；S3、样品的提取和净化，提取衍生，将动物代谢物搅拌均匀，转移到100mL干净的小烧杯中，用玻璃棒将其搅拌均匀，称取（5.0±0.1）g代谢物样品，置50mL具塞离心管中，加入0.4%二硫赤藓醇提取液10mL，涡旋1～2min混匀，50℃水浴30min，每隔3～5min涡旋振荡1次，振荡后立即放入水浴中，30min后置于室温，冷却后加入4%碘乙酰胺溶液3mL，涡旋1～2min混匀，室温避光衍生30min，每隔10min，涡旋混匀1次，衍生完毕后加入0．025mol/L磷酸缓冲液5mL，调节pH值至2.5～3.0，于4℃10000r/min离心20min，取上清液置于另一离心管中，备用净化，用3mL甲醇、3mL磷酸缓冲液预先将C18固相萃取柱活化，然后将上清液加入柱中，用10mL超纯水淋洗，真空固相萃取装置抽干，最后用5mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，45℃氮气吹干，用0．5mL流动相溶解，涡旋振荡5min，超声5min，0.22μm微孔滤膜过滤，取100μL进行HPLC检测；S4、回收率和精密度确定，称代谢物5g，置于50mL聚丙烯离心管中，分别加入0.1、1.0、10.0μg/mL的标准工作液各1mL，经上述方法提取和净化后，HPLC检测，求得鸡蛋样品中头孢噻呋在0.02、0.20、2.00μg/g水平上的回收率，测定时，每个浓度处理在同一工作日内测定5次（日内）；在不同工作日测定5批次（日间），每批次5次重复，分别计算日内和日间的色谱峰面积平均值及标准误，求日内和日间相对标准偏差（RS）；S5、灵敏度测定称取5份空白鸡蛋匀浆各5g，置于50mL聚丙烯离心管中，分别加0.05、0.10、0.25、0.50、1.00μg/mL的标准工作液各1mL，使每1g鸡蛋匀浆含头孢噻呋0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg，按上述方法提取、净化。优选的，步骤S1中的标准储备液包括精密称取10．0mg头孢噻呋标准品，置于100mL容量瓶内，用磷酸缓冲液溶解并稀释定容至刻度，即成浓度为100μg/mL的头孢噻呋储备液，临用前用磷酸缓冲液配成系列标准浓度，标准工作液包括取1mL头孢噻呋储备液，依次用磷酸缓冲液稀释定容至10.00、5.00、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05μg/mL，硼酸缓冲液包括0.05mol/L硼酸缓冲液（pH值9），准确称取四硼酸钠19.05g、氯化钾3.70g，定容至1000mL，磷酸缓冲液包括0.025mol/L磷酸缓冲液（pH值7）：准确称取3．4g磷酸二氢钾，加水约700mL后用氢氧化钾调节pH值至7.0，定容至1000mL，二硫赤藓醇提取液包括0.4%二硫赤藓醇提取液：称取4.0g二硫赤藓醇，溶于1000mL0.05mol/L硼酸缓冲液中（现配现用），碘乙酰胺溶液包括4%碘乙酰胺溶液：称取4.0g碘乙酰胺，溶于100mL0.025mol/L磷酸缓冲液中（现配现用），流动相，分别量取800mL水，1mL三氟乙酸，200mL乙腈，然后混匀。优选的，步骤S2中待检测物和设备检测前准备，包括：（1）全价不含抗菌药物的饲料，（2）色谱柱：AgilentZorbaxXDB－C18（4.6m×250mm×5μm，I.D），（3）检测器：紫外检测器，检测波长266nm；（4）流动相为水：三氟乙酸∶乙腈=800∶1∶200（体积比）；（5）柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：100μL。优选的，步骤S3中样品的提取和净化，提取衍生，取上清液置于另一离心管中，之后备用净化，用3mL甲醇、3mL磷酸缓冲液预先将C18固相萃取柱活化，然后将上清液加入柱中，用10mL超纯水淋洗，真空固相萃取装置抽干，最后用5mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，45℃氮气吹干，用0.5mL流动相溶解，涡旋振荡5min，超声5min，0.22μm微孔滤膜过滤，取100μL进行HPLC检测。本专利技术的有益效果：建立了用高效液相色谱技术测定代谢物中头孢噻呋残留的方法，代谢物样品经二硫赤藓醇提取，碘乙酰胺衍生，C18固相柱萃取净化，甲醇溶液洗脱，结果表明，该方法操作简便、快速、灵敏度高。具体实施方式基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒，包括色谱仪、二极管阵列检测器、色谱柱、漩涡混合器、电热恒温水浴锅、离心机、分析天平、匀浆机、氮气吹干仪和双重水蒸馏器、头孢噻呋标准品、乙腈、甲醇为色谱纯、二硫赤藓醇（纯度99%）、碘乙酰胺（纯度99%）、三氟乙酸和四硼酸钠等，其特征在于：该头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒检测步骤为：S1、配制主要溶液，主要溶液包括标准储备液、标准工作液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、二硫赤藓醇提取液、碘乙酰胺溶液和流动相；S2、待检测物和设备检测前准备，包括：（1）全价不含抗菌药物的饲料，（2）色谱柱；（3）检测器；（4）流动相为水；S3、样品的提取和净化，提取衍生，将动物代谢物搅拌均匀，转移到100mL干净的小烧杯中，用玻璃棒将其搅拌均匀，称取（5.0±0.1）g代谢物样品，置50mL具塞离心管中，加入0.4%二硫赤藓醇提取液10mL，涡旋1～2min混匀，50℃水浴30min，每隔3～5min涡旋振荡1次，振荡后立即放入水浴中， 30min后置于室温，冷却后加入4%碘乙酰胺溶液3mL，涡旋1～2min混匀，室温避光衍生30min，每隔 10min，涡旋混匀1次，衍生完毕后加入0．025mol/L磷酸缓冲液5mL，调节pH值至2.5～3.0，于4℃10000r/min离心20min，取上清液置于另一离心管中；S4、回收率和精密度确定，称代谢物5g，置于50mL聚丙烯离心管中，分别加入0.1、1.0、10.0μg/mL的标准工作液各1mL，经上述方法提取和净化后，HPLC检测，求得鸡蛋样品中头孢噻呋在0.02、0.20、2.00μg/g水平上的回收率，测定时，每个浓度处理在同一工作日内测定5次（日内）；在不同工作日测定5批次（日间），每批次5次重复，分别计算日内和日间的色谱峰面积平均值及标准误，求日内和日间相对标准偏差（RS）；S5、灵敏度测定称取5份空白鸡蛋匀浆各5g，置于50mL聚丙烯离心管中，分别加0.05、0.10、0.25、0.50、1.00μg/mL的标准工作液各1mL，使每1g鸡蛋匀浆含头孢 噻呋0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg，按上述方法提取、净化。...

【技术特征摘要】
1.一种头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒，包括色谱仪、二极管阵列检测器、色谱柱、漩涡混合器、电热恒温水浴锅、离心机、分析天平、匀浆机、氮气吹干仪和双重水蒸馏器、头孢噻呋标准品、乙腈、甲醇为色谱纯、二硫赤藓醇（纯度99%）、碘乙酰胺（纯度99%）、三氟乙酸和四硼酸钠等，其特征在于：该头孢噻呋代谢物检测方法及试剂盒检测步骤为：S1、配制主要溶液，主要溶液包括标准储备液、标准工作液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、二硫赤藓醇提取液、碘乙酰胺溶液和流动相；S2、待检测物和设备检测前准备，包括：（1）全价不含抗菌药物的饲料，（2）色谱柱；（3）检测器；（4）流动相为水；S3、样品的提取和净化，提取衍生，将动物代谢物搅拌均匀，转移到100mL干净的小烧杯中，用玻璃棒将其搅拌均匀，称取（5.0±0.1）g代谢物样品，置50mL具塞离心管中，加入0.4%二硫赤藓醇提取液10mL，涡旋1～2min混匀，50℃水浴30min，每隔3～5min涡旋振荡1次，振荡后立即放入水浴中，30min后置于室温，冷却后加入4%碘乙酰胺溶液3mL，涡旋1～2min混匀，室温避光衍生30min，每隔10min，涡旋混匀1次，衍生完毕后加入0．025mol/L磷酸缓冲液5mL，调节pH值至2.5～3.0，于4℃10000r/min离心20min，取上清液置于另一离心管中；S4、回收率和精密度确定，称代谢物5g，置于50mL聚丙烯离心管中，分别加入0.1、1.0、10.0μg/mL的标准工作液各1mL，经上述方法提取和净化后，HPLC检测，求得鸡蛋样品中头孢噻呋在0.02、0.20、2.00μg/g水平上的回收率，测定时，每个浓度处理在同一工作日内测定5次（日内）；在不同工作日测定5批次（日间），每批次5次重复，分别计算日内和日间的色谱峰面积平均值及标准误，求日内和日间相对标准偏差（RS）；S5、灵敏度测定称取5份空白鸡蛋匀浆各5g，置于50mL聚丙烯离心管中，分别加0.05、0.10、0.25、0.50、1.00μg/mL的标准工作液各1mL，使每1g鸡蛋匀浆含头孢噻呋0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg，按上述方法提取、净化。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春城，徐静，吴敏芳，胡勇，蒋韦艳，刘金杰，
申请(专利权)人：无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32