呋喃唑酮代谢物ELISA检测试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及一种检测动物源性食品中呋喃唑酮代谢物的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒。该试剂盒组成包括：９６孔酶标板、酶标二抗、呋喃唑酮代谢物抗体浓缩液、呋喃唑酮代谢物标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、２－硝基苯甲醛、高浓度标准品、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ＥＬＩＳＡ方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的呋喃唑酮代谢物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃唑酮代谢物抗体，加入酶标二抗后，用ＴＭＢ底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃唑酮代谢物的残留量。与仪器分析技术相比具有操作简便、费用低廉、灵敏度高等特点。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及动物源性食品中药物物残留量的检测试 剂盒，特别是检测动物源性食品中呋喃唑酮代谢物残留量的试剂盒。(二)
技术介绍
硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特 性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实 验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基 因突变，正因为如此才导致此类药物禁止在治疗和饲料中使用。呋喃唑酮在1995 年被禁用。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物 则能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后 的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基吹喃类残留的目的。 吹喃唑酮代谢产物AOZ; ^^喃它酮代谢产物AMOZ;硝基吹喃托英代谢产物 AHD;硝基糠腙(呋喃西林)代谢产物SEM。用来检测呋喃唑酮代谢物的最常用方法是LC-UV， LC-MS和LC-MS/MS，但其检测样本的搡作步骤麻烦，检测时间长， 一次性检测样本少。(三)
技术实现思路
本技术所要解决的问题是提供一种小巧轻便的 呋喃唑酮代谢物残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高， 成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中吹喃唑 酮代谢物含量的测定，减少了检验样本所需要的时间。本技术的技术方案是采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固相载体，放入 真空铝铂袋中，在试剂盒酶标板微孔条上预包被呋喃唑酮代谢物偶联抗原制成 检测板，以塑料硬膜为盖板膜，将40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液、15.1mg 2-硝基苯甲醛、12ml酶标二抗、0.8ml呋喃唑酮代谢物抗体浓缩液、7ml显色液 A液、7ml显色液B液、7ml终止液和6瓶lml梯度浓度的标准品溶液及lml 高浓度标准品溶液，试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定 在泡沫塑料模具中与试剂板、盖板膜一同封装在盒内，以便于携带和运输。每 一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连 续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。检测时，样本中的残留物(吹 喃唑酮代谢物)将和酶标板微孔条上预包被的偶联呋喃唑酮代谢物抗原竟争抗TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含残留物。夫喃唑酮代谢物)的含量 成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中吹喃唑 酮代谢物的残留量，其搡作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度组织/蜂蜜的最低检测限为 0.1|ig/kg、鸡蛋的最低检测限为0.1(ig/kg、虾/鱼等水产组织(因存在一定的干扰) 检测下限为0.2吗/kg;水产、肌肉、肝脏组织的回收率为75%±15%、蜂蜜的回 收率为90%±15%、鸡蛋的回收率为90±20%,同其他呋喃唑酮代谢物类药物的交叉反应率为<0.01%。相对于其他p夫喃唑酮代谢物残留检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、勻质器、振荡机和微量加样器，同类实验室一 般均有配备，所需成本较低。本实验新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于动物源性食 品中吹喃唑酮代谢物残留的检测。附图说明图1为本实验新型酶联板的侧面横剖面图(长为12.8cm);图2为本实验新型酶联板的俯视图3为本实验新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8.55cm);图4为本实验新型盖板膜平面图5为本实验新型试剂瓶纵剖面平面图6为本实验新型固定泡沬模具的俯视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被呋喃唑酮代谢物偶联抗原(3)固 定于酶标板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜 (4)用于酶标板置水洛或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2);透明帽的 半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂 瓶(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于 封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色 液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的 白色塑料试剂瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料试剂瓶(8) 用于封装0.8ml呋喃唑酮代谢物抗体浓缩液，黑色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用 于封装15.1mg 2-硝基苯甲醛，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装lml/瓶 的标准品溶液及lml高浓度标准品溶液；泡沬塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)， 50ml浓缩复溶液(11 ), 7ml显色 液A液瓶位(14)， 7ml显色液B液瓶位(13)， 7ml终止液瓶位(12), 0.8ml 呋喃唑酮代谢物抗体浓縮液瓶位(16)， 12ml酶标二抗瓶位(15), 6种lml/瓶 各种浓度的标准品溶液及1瓶lml高浓度标准品溶液瓶位(17), 15.1mg2-硝基 苯甲醛的瓶位(17)。本实验新型的实施例一、样本的前处理1.配液配液l:复溶工作液用去离子水将2x浓缩复溶液按1: 1体积比进行稀释(1份2x 浓缩复溶液+l份去离子水)用于样本的复溶配液2:衍生化试剂向装有2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加甲醇溶解定容至10ml (浓 度为10mM)。配液3: O.IM磷酸氢二钾溶液称取22.8g三水合磷酸氢二钾加去离子水溶解定容至1L。配液4: C液(供奶样用)0.36M亚硝基铁氰化钠(Na2Fe(CN)5'NO2H20 )溶液12.5g亚硝基铁氰化钠加去离子水定容至100ml配液5: D液(供奶样用)1M硫酸锌(ZnS04'7H20)溶液29.8g硫酸锌用去离子水定容至100m配液6: 1M盐酸溶液量取8.3ml浓盐酸加入到盛有去离子水的容器中定容至 謂ml。配液7: 1M氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠加去离子水溶解定容至100ml。 配液8:洗涤工作液用去离子水将20x浓缩洗涤液按1: 19体积比进行稀释(或按 一需量稀释)(1份20x浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的 洗涤2. 肌肉、肝脏、水产(鱼虫下等)组织前处理方法用均质器均质样本；称取1.0土0.05g均质后的组织样本(肝样/肉样)至50ml 聚苯乙烯离心管中，分别加入4ml的去离子水、0.5ml 1M盐酸和10(^1衍生化 试剂，用振荡器充分振荡2min;在37°C过夜孵育(大约16h);分别加入5ml 0.1M 磷酸氢二钾溶液、0.4ml 1M氢氧化钠溶液和5ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡 30s; 3000g以上，室温(20-25°C/68-77°F )离心10min;取2.5ml乙酸乙酯相至 10ml干燥的玻璃试管中，于50 6(TC氮气流下吹干；加入lml正己烷(或正庚 烷)，用涡旋仪涡动30s,再加入lml复溶工作液，用涡旋仪涡动lmin充分混勻， 3000g以上，室温(20-25。C/68-77°F )离心10min;除去上层有机相，取下层水 相50pl用于分析。3. 牛奶样本前处理取牛奶样本，3000g以上，1(TC离心10min,吸除上层脂肪；取5ml去除脂 肪牛奶样本至10ml玻璃离心管中；分别加入250jal C液和250^1 D液；用振荡 器充分振荡混合，3000g以上，4~12°C (3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测动物源性食品中呋喃唑酮代谢物的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块９６孔的酶标板、一张盖板膜、１５瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：酶标板是采用９６孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被呋喃唑酮代谢物偶联抗原制成的检测板，１５瓶试剂分别为６瓶标准品溶液、１瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、呋喃唑酮代谢物抗体浓缩液、显色液Ａ液、显色液Ｂ液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、２－硝基苯甲醛，下凹瓶位共１５个。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，沈建忠，万宇平，冯才伟，刘玉梅，汪善良，吴小平，孙倩，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，北京望尔康泰生物技术有限公司，
类型：实用新型
国别省市：11[中国|北京]