一种蛇形菌素人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测蛇形菌素的酶联免疫试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、蛇形菌素标准品溶液、蛇形菌素抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为蛇形菌素偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的蛇形菌素抗体，所述蛇形菌素抗体是由免疫原免疫动物得到的。本发明专利技术还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测蛇形菌素的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的酶联免疫试剂盒可用于检测谷物和饲料样本中蛇形菌素的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种蛇形菌素人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
本专利技术涉及一种蛇形菌素人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用技术，具体涉及一种蛇形菌素人工抗原分子结构以及用于检测蛇形菌素的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测谷物和饲料中蛇形菌素药物的残留量。
技术介绍
蛇形菌素，又称二乙酰镳草镰孢菌烯醇(DAS)，与T-2毒素相似，均属于单端孢霉烯族化合物，主要污染粮食作物与饲料，毒性较DON高，损伤人和动物的多种组织器官，与T-2毒素的作用相似。为了减少其对人畜的影响，有效而快速地检测食物及饲料中的DAS就显得非常重要。与传统应用的生物学检测法、薄层层析法、高效液相色谱法等相比，免疫化学检测法对真菌毒素时检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学法检测DAS的前提则是需要具备针对DAS的抗体。本专利技术为快速检测方法，用时短，操作简单，成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够检测谷物和饲料中蛇形菌素药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。本专利技术试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、蛇形菌素标准品溶液、蛇形菌素抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为蛇形菌素偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的蛇形菌素抗体。所述蛇形菌素特异性抗体是以一种蛇形菌素人工抗原作为免疫原制备获得，所述蛇形菌素特异性抗体可为蛇形菌素单克隆抗体或蛇形菌素多克隆抗体，其中优选蛇形菌素单克隆抗体。所述酶结合物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶结合物是由酶和蛇形菌素抗体偶联得到的。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括蛇形菌素标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液。所述蛇形菌素标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.4μg/L，0.8μg/L，1.6μg/L，3.2μg/L，6.4μg/L。当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸溶液或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。本专利技术中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。本专利技术的检测原理为：本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的蛇形菌素和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗蛇形菌素的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物蛇形菌素的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中蛇形菌素的残留量。本专利技术还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测蛇形菌素的方法，它包括步骤：(1)样品前处理；(2)用试剂盒进行检测；(3)分析检测结果。本专利技术检测蛇形菌素的酶联免疫试剂盒主要采用ELISA方法定性或定量检测样品中蛇形菌素的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本专利技术的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。附图说明图1：蛇形菌素半抗原的分子结构式具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1试剂盒组分的制备1、蛇形菌素半抗原的制备取蛇形菌素20mg，加DMF10ml溶解，加三乙胺0.1ml，充分搅拌后，加羰基二咪唑(CDI)17mg，室温反应2h，加DL-高半胱氨酸14mg，继续搅拌12h，停止反应，加水70ml，乙酸乙酯80ml，充分震荡，静置，分去水相，有机相无水硫酸钠干燥，蒸干，得到黄色油状物，加乙腈/正己烷(v/v，1/10)3ml，重结晶，得DL-高半胱氨酸-蛇形菌素半抗原产物25.2mg，收率73％。2、抗原的制备免疫原制备——蛇形菌素半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原。取19mgDL-高半胱氨酸-蛇形菌素半抗原，加DMF1ml溶解，得到A液；取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加0.1MPB缓冲液溶解，加4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯12mg，室温反应6h，得到B液，将A液缓慢滴加到B液中，室温反应7h，0.02MPBS透析纯化3天，每天换液3次，得到蛇形菌素-BSA偶联物，即为免疫原，分装，-20℃保存，备用。包被原制备——蛇形菌素半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到免疫原。取6mgDL-高半胱氨酸-蛇形菌素半抗原，加DMSO1ml溶解，加N-甲基吗啉0.1ml，充分混匀，加氯甲酸异丁酯0.11ml，0-5℃反应3h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白(OVA)50mg，加0.1MPB缓冲液溶解，得到B液，将A液缓慢滴加到B液中，室温反应7h，0.02MPBS透析纯化3天，每天换液3次，得到蛇形菌素-OVA偶联物，即为包被原，分装，-20℃保存，备用。3、蛇形菌素单克隆抗体的制备动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×105个/只，7天本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测蛇形菌素的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括：包被有包被原的酶标板、蛇形菌素标准品溶液、蛇形菌素抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为蛇形菌素偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的蛇形菌素抗体，所述蛇形菌素抗体是由免疫原免疫动物得到的，所述蛇形菌素偶联抗原是由蛇形菌素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述蛇形菌素半抗原是由蛇形菌素与DL-高半胱氨酸等物质经过一系列化学反应得到的。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测蛇形菌素的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括：包被有包被原的酶标板、蛇形菌素标准品溶液、蛇形菌素抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为蛇形菌素偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的蛇形菌素抗体，所述蛇形菌素抗体是由免疫原免疫动物得到的，所述蛇形菌素偶联抗原是由蛇形菌素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述蛇形菌素半抗原是由蛇形菌素与DL-高半胱氨酸等物质经过一系列化学反应得到的。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述蛇形菌素半抗原的分子结构式为：





3.如权利要求1所述的试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉梅，崔海峰，冯才伟，宋灏，王兆芹，马玉华，彭正学，周兵强，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11