噁霜灵半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了噁霜灵半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法，以及将其应用于酶联免疫试剂盒，试剂盒包括：包被有包被原的酶标板、噁霜灵标准品溶液、噁霜灵抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为噁霜灵偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的噁霜灵抗体，所述噁霜灵抗体是由免疫原免疫动物得到的。本发明专利技术还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测噁霜灵的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的酶联免疫试剂盒可用于检测烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)样本中噁霜灵的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。能够现场监控且适合大量样本的筛查。能够现场监控且适合大量样本的筛查。

【技术实现步骤摘要】
噁霜灵半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种噁霜灵半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术，具体涉及一种噁霜灵人工抗原分子结构以及用于检测噁霜灵的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)中噁霜灵药物的残留量。

技术介绍

[0002]噁霜灵是一类内吸性农用杀菌剂，杀菌广谱，对霜霉目病源菌具有很高的防效，有保护和治疗作用，持效期长，主要用于防治蔬菜、瓜果等病害。由于农药在使用过程中普遍存在并会污染到环境中。GB 2763
‑
2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》对蔬菜中的最大残留限量为0.5mg/kg；中国烟草总公司发布的YQ50
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2014《烟叶农药最大残留限量》对烟叶中噁霜灵的最大残留限量为0.1mg/kg。
[0003]检测噁霜灵的方法有气相色谱法、气相色谱法
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串联质谱法、超高效液相色谱
‑
质谱/质谱法、液相色谱
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质谱/质谱法等。与上述方法相比，免疫化学检测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学法检测噁霜灵的前提是需要具备针对噁霜灵的抗体，本申请专利技术了噁霜灵人工抗原制备方法，并将其应用于酶联免疫试剂盒中，用时短，操作简单，成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种能够检测烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)中噁霜灵药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。
[0005]本专利技术试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、噁霜灵标准品溶液、噁霜灵抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为噁霜灵偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的噁霜灵抗体。
[0006]所述噁霜灵特异性抗体是以一种噁霜灵人工抗原作为免疫原制备获得，所述噁霜灵特异性抗体可为噁霜灵单克隆抗体或噁霜灵多克隆抗体，其中优选噁霜灵单克隆抗体。
[0007]所述酶结合物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶结合物是由酶和噁霜灵抗体偶联得到的。
[0008]为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括噁霜灵标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液。
[0009]所述噁霜灵标准品溶液6瓶，浓度分别为0mg/L，0.1mg/L，0.3mg/L，0.9mg/L，2.7mg/L，8.1mg/L。
[0010]当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸溶液或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸
盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。
[0011]所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温
‑
20、0.01
‰
～0.03
‰
叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0012]其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0013]本专利技术中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0014]本专利技术的检测原理为：
[0015]本试剂盒采用ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的噁霜灵和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗噁霜灵的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物噁霜灵的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中噁霜灵的残留量。
[0016]本专利技术还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测噁霜灵的方法，它包括步骤：
[0017](1)用试剂盒进行检测；
[0018](2)分析检测结果。
[0019]本专利技术检测噁霜灵的酶联免疫试剂盒主要采用ELISA方法定性或定量检测样品中噁霜灵的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本专利技术的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。
附图说明
[0020]图1：噁霜灵半抗原的分子结构式
具体实施方式
[0021]下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。
[0022]实施例1试剂盒组分的制备
[0023]1、噁霜灵半抗原的制备
[0024]取2.98g化合物a，加甲苯100ml溶解，加2.24g叔丁醇钾，加巯基丙酸1.27g，充分搅拌后加入醋酸铅0.3g，加配体(R)
‑
(
‑
)
‑1‑
[(S)
‑2‑
(二环己基膦)二茂铁]乙基二叔丁基膦0.5g，搅拌，加热110℃反应4h，停止反应，旋蒸除去甲苯，加水200ml，加1mol/L盐酸调节pH值到6，加乙酸乙酯200ml萃取，有机相蒸干，上硅胶柱，二氯甲烷/甲醇(v/v,10/1)洗脱分离，得到化合物b1.21g，即为半抗原产物，收率32.88％。
[0025]2、抗原的制备
[0026]免疫原制备——噁霜灵半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原。
[0027]取化合物b 12.26mg，加1mlDMF溶解澄清，加NHS6.77mg，EDC9.57mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取匙孔血蓝白蛋白(KLH)50mg，加0.1M CB9.5缓冲液4ml溶解，得到B液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02M PBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到噁霜灵
‑
KLH偶联物，即为免疫原。
[0028]包被原制备——噁霜灵半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原。
[0029]取化合物b16.35mg，加1mlDMF溶解澄清，加NHS11.2mg，EDC13.57mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白(OVA)100mg，加0.1M CB9.5缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草中噁霜灵检测用半抗原，其特征在于，分子式：C
16
H
20
N2O6S，结构式如下：2.一种含如权利要求1中所述烟草中噁霜灵检测用半抗原的酶联免疫试剂盒。3.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括：包被有包被原的酶标板、噁霜灵标准品溶液、噁霜灵抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液。4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述包被原为噁霜灵偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的噁霜灵抗体，所述噁霜灵抗体是由免疫原免疫动物得到的，所述噁霜灵偶联抗原是由噁霜灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述噁霜灵半抗原是由噁霜灵与巯基丙酸等物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兆芹，惠光朋，张瑜，万宇平，杨海涛，崔海霞，马永慧，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：