米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及一种米酵菌酸半抗原。本发明专利技术还公开了所述半抗原的制备方法及其应用。基于米酵菌酸半抗原建立的酶联免疫试剂盒快速检测产品，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适用于食品中米酵菌酸的现场监控和大量样本的筛查。中米酵菌酸的现场监控和大量样本的筛查。中米酵菌酸的现场监控和大量样本的筛查。

【技术实现步骤摘要】
米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]米酵菌酸(bongkrekic acid，BA)是由椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的一种可引起食物中毒的毒素。食入该毒素污染的食物后可引起神经系统、消化系统及泌尿系统的损伤，严重情况下将导致全身主要脏器的衰竭，致死率高达40％～100％。米酵菌酸是发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其他变质淀粉类制品引起中毒的主要原因。近几年来，我国由米酵菌酸引起的食物中毒事件时有发生，随着经济社会的发展，人们对食品安全越来越重视，公众对米酵菌酸的检测需求随之日益增长，因此，开发一种简单快速、适用于米酵菌酸现场监控检测的分析方法具有重要的现实意义。
[0003]目前，检测米酵菌酸主要采用高效液相色谱法、液相色谱
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质谱联用法等分析方法，存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、高特异性、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器检测方法有很多优势。所以免疫分析为米酵菌酸研究提供了一条新的分析检测方法。
[0004]在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测米酵菌酸时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的米酵菌酸半抗原。专利CN110058008A公开了一种食品中米酵菌酸的免疫学检测方法，并提供了米酵菌酸人工抗原及抗米酵菌酸的多克隆抗体，检测灵敏度为50μg/L；刘秀梅等制备了米酵菌酸牛血清白蛋白结合物、卵清蛋白结合物，并获得了抗米酵菌酸的多克隆抗体，建立了检测BA的直接和间接竞争ELISA法，最低检出浓度分别为0.1mg/L和0.01mg/L(刘秀梅,余东敏,文卫华,等.米酵菌酸多克隆抗体的制备[J].卫生研究,1995,24(2):93
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95)，后又运用免疫杂交瘤技术获得了能分泌抗米酵菌酸的单克隆抗体细胞株，灵敏度可达10μg/L以下(刘秀梅,文卫华.米酵菌酸单克隆抗体细胞株的建立[J].卫生研究,1996,25(4):239
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241)。以上方法都采用将米酵菌酸直接与载体蛋白偶联制备人工抗原来免疫动物获得抗体，虽然都成功获得了抗体，但抗体灵敏度均较低。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种能最大程度保留米酵菌酸特征结构的半抗原以及这种半抗原的制备方法；以此半抗原制备的人工抗原、检测灵敏度高和特异性强的抗体；以及此半抗原的应用。
[0006]为了实现本专利技术的目的，第一方面，本专利技术提供一种米酵菌酸半抗原，它的分子结构式为：
[0007][0008]米酵菌酸分子中含有三个羧基，若与载体蛋白直接偶联，一方面米酵菌酸的特征结构易受载体的局部微化学环境或空间位阻的干扰，影响机体免疫系统的识别；另一方面，三个羧基都可能与载体偶联，必定会导致多种产物的产生，降低了人工抗原的收率。本专利技术提供的米酵菌酸半抗原在米酵菌酸的分子结构上引入巯基，并通过巯基与载体蛋白进行偶联得到人工抗原用于免疫；该米酵菌酸半抗原最大限度保留了米酵菌酸的特征结构，且可以实现定向偶联，提高了人工抗原的收率，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定基础。
[0009]第二方面，本专利技术提供上述米酵菌酸半抗原的制备方法，其包括如下步骤：
[0010]取米酵菌酸加甲苯溶解后，加入三乙胺中和至中性；加入氧化铜，搅拌，冷却到0℃，然后加入4,5
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二甲基
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[1,3]二氧戊环
‑2‑
硫酮充分搅拌，再加入四氯化钛，0℃下继续搅拌1h；加1mol/L盐酸淬灭反应，加水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，加无水硫酸钠干燥，有机相蒸干，得到巯基
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米酵菌酸，即为米酵菌酸半抗原。
[0011]进一步地，所述米酵菌酸和4,5
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二甲基
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[1,3]二氧戊环
‑2‑
硫酮的物质的量之比为1:1.2。
[0012]本专利技术根据米酵菌酸的结构特点，合理设计米酵菌酸半抗原的制备方法，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，制备的米酵菌酸半抗原的纯度和收率较高。
[0013]第三方面，本专利技术提供上述米酵菌酸半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述米酵菌酸半抗原与载体蛋白偶联得到的米酵菌酸人工抗原，及由所得米酵菌酸人工抗原免疫动物制备得到的米酵菌酸抗体。
[0014]所述米酵菌酸人工抗原的分子结构式为：
[0015][0016]所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。
[0017]所述抗体为米酵菌酸单克隆抗体。
[0018]第四方面，本专利技术还提供由上述米酵菌酸抗体制备的酶联免疫试剂盒，及其在检测食品中米酵菌酸的应用。
[0019]本专利技术提供的米酵菌酸半抗原最大程度保留了米酵菌酸的特征结构，使得米酵菌酸半抗原的免疫原性明显增强；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的人工抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，灵敏度可达到0.1μg/L；所得的抗体用于酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于食品中米酵菌酸的现场监控和大量样本的筛查。本专利技术的米酵菌酸半抗原
在米酵菌酸的检测中发挥重要作用。
附图说明
[0020]图1：米酵菌酸半抗原合成路线图
[0021]图2：米酵菌酸酶联免疫试剂盒标准曲线
具体实施方式
[0022]下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。
[0023]实施例1
[0024]一种米酵菌酸半抗原的制备方法，其包括如下步骤：
[0025]取4mg米酵菌酸加5mL甲苯溶解后，加入0.34mL三乙胺中和至中性；加入2mg氧化铜，搅拌，冷却到0℃，然后加入1.3mg 4,5
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二甲基
‑
[1,3]二氧戊环
‑2‑
硫酮充分搅拌，再加入0.27mL四氯化钛，0℃下继续搅拌1h；加0.3mL 1mol/L盐酸淬灭反应，加水20mL，乙酸乙酯60mL
×
3萃取三次，合并有机相，加5g无水硫酸钠干燥，有机相蒸干，得到巯基
‑
米酵菌酸3.2mg，即为米酵菌酸半抗原。
[0026]实施例2
[0027]一种米酵菌酸人工抗原的制备方法，步骤如下：
[0028]取10mg牛血清白蛋白(BSA)加1mL pH 9.1的CB缓冲液溶解，加入含1.5mg 4
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种米酵菌酸半抗原，其特征在于，它的分子结构式为：2.如权利要求1所述的米酵菌酸半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取米酵菌酸加甲苯溶解后，加入三乙胺中和至中性；加入氧化铜，搅拌，冷却到0℃，然后加入4,5
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二甲基
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[1,3]二氧戊环
‑2‑
硫酮充分搅拌，再加入四氯化钛，0℃下继续搅拌1h；加1mol/L盐酸淬灭反应，加水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，加无水硫酸钠干燥，有机相蒸干，得到巯基
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米酵菌酸，即为米酵菌酸半抗原。3.如权利要求2所述的米酵菌酸半抗原的制备方法，其特征在于，所述米酵菌酸和4,5
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二甲基
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[...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兆芹，崔海峰，凡静静，崔廷婷，何方洋，魏力杰，万宇平，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：