吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，本发明专利技术提供的吡唑醚菌酯半抗原既最大程度保留了吡唑醚菌酯的特征结构，使得吡唑醚菌酯半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用吡唑醚菌酯半抗原与载体蛋白偶联后得到的吡唑醚菌酯人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，经检测吡唑醚菌酯抗体的灵敏度可达0.1μg/L，与其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的交叉反应率低，为后续建立吡唑醚菌酯的各种免疫分析方法提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于食品安全检测领域。更具体地，本专利技术涉及吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)，又名唑菌胺酯，是一种新型广谱甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有杀菌谱广、活性高、持效期长、毒性低、对非靶标生物安全等特点，主要用于防治果蔬等作物上由子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲和卵菌纲真菌引起的叶枯病、锈病、白粉病、霜霉病、疫病、炭疽病、疮痂病、褐斑病、立枯病、稻瘟病等多种病害。我国国家标准GB2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了不同食品中吡唑醚菌酯的残留限量。目前，国内外检测吡唑醚菌酯主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱串联质谱法等分析方法，存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。所以免疫分析为吡唑醚菌酯残留研究提供了一条新的分析检测方法。在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测吡唑醚菌酯残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的吡唑醚菌酯半抗原。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种能最大程度保留吡唑醚菌酯的特征结构，又具有一定长度连接臂的半抗原以及这种半抗原的制备方法；以此半抗原制备的人工抗原、检测灵敏度高和特异性强的抗体；以及此半抗原的应用。为了实现本专利技术的目的，第一方面，本专利技术提供一种吡唑醚菌酯半抗原，其具有如下结构式：本专利技术提供的吡唑醚菌酯半抗原在吡唑醚菌酯的分子结构上引入羧基活性基团，从而可以与载体蛋白进行偶联得到人工抗原用于免疫；该吡唑醚菌酯半抗原保留了吡唑醚菌酯的所有特征基团，最小改变吡唑醚菌酯原有结构特征，同时与载体蛋白偶联后，突出的是吡唑醚菌酯本身独有的结构，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定基础。第二方面，本专利技术提供上述吡唑醚菌酯半抗原的制备方法，其包括如下步骤：1)在碱性条件下，将甲基2-(溴甲基)-4-碘苯(甲氧基)氨基甲酸酯与1-(4-氯苯基)-2H-吡唑啉-3-酮进行亲核取代反应得到中间体1，所述中间体1具有结构式2)在碱性条件下，将所述中间体1与氨基丁酸发生亲核取代反应，得到吡唑醚菌酯半抗原。进一步地，上述步骤1)包括如下步骤：所述碱性条件由KOH提供，所述甲基2-(溴甲基)-4-碘苯(甲氧基)氨基甲酸酯、1-(4-氯苯基)-2H-吡唑啉-3-酮、KOH的物质的量之比为1:1:2；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述反应条件为：油浴加热80℃反应7h；所述步骤1)反应结束后，还包括对反应体系进行后处理的步骤，具体如下：将反应体系冷却到室温，加入水，加乙酸乙酯萃取，有机相水洗后蒸干获得中间体1。进一步地，上述步骤2)包括如下步骤：所述碱性条件由氢化钠提供，所述中间体1、氨基丁酸、氢化钠的物质的量之比为1:1:2；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为二甲基亚砜；所述反应条件为：100℃反应9h；所述步骤2)反应结束后，还包括对反应体系进行后处理的步骤，具体如下：将反应体系冷却到室温，加入水，用盐酸调节pH至5，加乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，水洗，旋蒸浓缩，上硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯体积比为3:1的混合溶剂洗脱分离获得吡唑醚菌酯半抗原。本专利技术根据吡唑醚菌酯的结构特点，通过两步取代反应产生带有羧基的间隔臂，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，制备的吡唑醚菌酯半抗原的纯度和收率较高。第三方面，本专利技术提供一种吡唑醚菌酯人工抗原，其是载体蛋白和上述吡唑醚菌酯半抗原偶联得到的偶联物。所述吡唑醚菌酯人工抗原可以作为免疫原，也可以作为包被原。进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白；优选牛血清白蛋白、卵清蛋白。更具体的如：吡唑醚菌酯半抗原-牛血清白蛋白(BSA)形成的免疫原；吡唑醚菌酯半抗原-卵清蛋白(OVA)形成的包被原。吡唑醚菌酯半抗原分子仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性。因此，为了赋予吡唑醚菌酯半抗原分子以免疫原性，还需要将该吡唑醚菌酯半抗原分子与合适的载体蛋白分子偶联、结合在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的吡唑醚菌酯人工抗原。第四方面，本专利技术提供一种吡唑醚菌酯抗体，它是由上述吡唑醚菌酯人工抗原经动物免疫得到，其能与吡唑醚菌酯发生特异性免疫反应。进一步地，所述吡唑醚菌酯抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。另外，对于所述吡唑醚菌酯抗体，可以采用本领域常规方法来进行制备。在一个具体的实施方案中，所述吡唑醚菌酯抗体为特异性针对上述吡唑醚菌酯半抗原的吡唑醚菌酯人工抗原的鼠源单克隆抗体。采用本专利技术的吡唑醚菌酯人工抗原得到的吡唑醚菌酯抗体的效价、特异性、亲和力都较好，与其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的交叉反应率低。第五方面，本专利技术提供上述吡唑醚菌酯抗体在检测吡唑醚菌酯残留中的应用。本专利技术通过吡唑醚菌酯人工抗原诱导免疫动物产生抗体，从而用于吡唑醚菌酯免疫检测分析中。所述的吡唑醚菌酯免疫检测包括但不限于吡唑醚菌酯ELISA试剂盒、吡唑醚菌酯胶体金试纸条、吡唑醚菌酯时间分辨荧光试纸条。借由上述技术方案，本专利技术至少具有如下优点及有益效果：本专利技术提供的吡唑醚菌酯半抗原既最大程度保留了吡唑醚菌酯的特征结构，使得吡唑醚菌酯半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用吡唑醚菌酯半抗原与载体蛋白偶联后得到的吡唑醚菌酯人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，为后续建立吡唑醚菌酯的各种免疫分析方法提供基础。本专利技术中吡唑醚菌酯半抗原的制备方法，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，制备的吡唑醚菌酯半抗原的纯度和收率较高。采用本专利技术的吡唑醚菌酯人工抗原得到的吡唑醚菌酯抗体的效价、特异性、亲和力都较好，灵敏度可达到0.1μg/L，与其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的交叉反应率低。附图说明图1是本专利技术吡唑醚菌酯半抗原的合成路线具体实施方式下面结合具体实施例进一步详细说明本专利技术，但实施例仅是本专利技术的优选实施方式，并不是对本专利技术的限定。实施例1一种吡唑醚菌酯半抗原的制备方法，其包括如下步骤：1)取4.0g甲基2-(溴甲基)-4-碘苯(甲氧基)氨基甲酸酯溶解于80mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1.12gKOH和1.94g1-(4-氯苯基)-2H-吡唑啉-3-酮，充分搅拌后，加入0.33g无水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种吡唑醚菌酯半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：/n

【技术特征摘要】
1.一种吡唑醚菌酯半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：





2.如权利要求1所述的吡唑醚菌酯半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)在碱性条件下，将甲基2-(溴甲基)-4-碘苯(甲氧基)氨基甲酸酯与1-(4-氯苯基)-2H-吡唑啉-3-酮进行亲核取代反应得到中间体1，所述中间体1具有结构式



2)在碱性条件下，将所述中间体1与氨基丁酸发生亲核取代反应，得到吡唑醚菌酯半抗原。


3.如权利要求2所述的吡唑醚菌酯半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤1)包括如下步骤：所述碱性条件由KOH提供，所述甲基2-(溴甲基)-4-碘苯(甲氧基)氨基甲酸酯、1-(4-氯苯基)-2H-吡唑啉-3-酮、KOH的物质的量之比为1:1:2；
所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；
所述反应条件为：油浴加热80℃反应7h；
所述步骤1)反应结束后，还包括对反应体系进行后处理的步骤，具体如下：将反应体系冷却到室温，加入水，加乙酸乙酯萃取，有机相水洗后蒸干获得中间体1。


4.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兆芹，万宇平，何方洋，马玉华，张瑜，崔娜，凡静静，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11