本发明专利技术提供了一种同时检测呋喃它酮代谢物（AMOZ）、孔雀石绿（MG）及隐孔雀石绿（LMG）的免疫检测方法。本发明专利技术科学合成AMOZ半抗原和LMG半抗原，将其分别与载体蛋白偶联制备人工抗原。利用AMOZ人工抗原和LMG人工抗原，分别制备针对两种对象的杂交瘤细胞株，采用杂交‑杂交瘤技术制备分泌同时抗AMOZ和LMG的双特异性抗体，并成功建立多残留免疫检测方法，实现对AMOZ、MG及LMG的同时检测，对AMOZ的检测限为0.1 ng/mL，半抑制浓度为1.3 ng/mL，对LMG的检测限为4.8 ng/mL，半抑制浓度为45.3 ng/mL。本发明专利技术方法特异性强，灵敏度较高，操作方法简便，在食品中AMOZ、MG及LMG的多残留检测方面具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品安全检测
，更具体地，涉及一种同时检测呋喃它酮代谢物AMOZ、孔雀石绿及隐孔雀石绿的免疫检测方法。
技术介绍
呋喃它酮和孔雀石绿是水产品中经常检出的禁用药物。呋喃它酮代谢物AMOZ(CAS号：43056-63-9)是呋喃它酮在动物体内的代谢产物，能以蛋白结合物的形式长期稳定存在于动物组织内，可以通过检测代谢产物的手段来分析呋喃它酮残留。隐孔雀石绿(LMG，CAS号：129-73-7)是孔雀石绿(MG，CAS号：2437-29-8)在水生动物体内的主要代谢产物，能在动物组织中蓄积，长期稳定存在。AMOZ、MG及LMG所造成的危害主要表现在它们所存在的毒性作用，以及可能对生物体引起的过敏反应和变态反应，潜在的致畸、致癌、致突变作用等。目前，国内外有很多与AMOZ、MG及LMG免疫检测相关的研究报道，但这些研究主要集中于单一对象检测。由于环境及食品中组分复杂，单一对象的免疫分析方法已难以满足实际检测的需要。AMOZ和MG、LMG都是水产品经常检测的指标。目前国内外暂无AMOZ、MG及LMG的多残留免疫检测方法，因此，同时针对三者提供一种简便、快速的免疫检测方法是非常有必要并亟需的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有AMOZ、MG及LMG单残留免疫检测技术的不足，提供一种可应用于同时检测AMOZ、MG及LMG的AMOZ半抗原及人工抗原、LMG半抗原及人工抗原和能同时识别AMOZ和LMG的双特异性抗体。本专利技术要解决的另一技术问题是提供一种同时检测AMOZ、MG及LMG的免疫检测方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：提供一种AMOZ半抗原，具有如式(I)所示的结构，记为AMOZMB：本专利技术提供了所述AMOZ半抗原AMOZMB的制备方法，包括以下步骤：将4-巯基苯甲醛和AMOZ分别溶于无水甲醇中，搅拌过程中将AMOZ的甲醇溶液缓慢滴加到入4-巯基苯甲醛的甲醇溶液中，室温搅拌过夜。反应结束后过滤，分别用蒸馏水和无水甲醇洗涤，干燥，得产物AMOZMB。本专利技术提供了一种AMOZ人工抗原，具有如式(Ⅱ)所示的结构：本专利技术提供了上述AMOZ人工抗原的制备方法：AMOZMB作为半抗原与载体蛋白通过双功能试剂交联法制备得到。所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白质或卵清蛋白；所述透析液为生理盐水或0.01mol/LPBS溶液(pH7.4)。具体地，所述双功能试剂交联法包括如下步骤：S11.将载体蛋白溶于PBS溶液中，记为A液；S12.将双功能试剂溶于N,N-二甲基甲酰胺中，记为B液；S13.在一定温度下磁力搅拌，将B液逐滴加入A液中，反应一段时间后，用透析液透析，得溶液C；S14.将AMOZMB半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将此溶液逐滴加入C液中，反应一段时间后，用透析液透析，得到人工抗原。本专利技术同时提供一种LMG半抗原，具有如式(Ⅲ)所示的结构，记为LMGMB：本专利技术提供了所述LMG半抗原LMGMB的制备方法，包括以下步骤：将4-巯基苯甲醛溶于无水甲醇中，向其中加入N,N-二甲基苯胺和催化剂BOP(化学名：六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷)，在氮气保护情况下加热回流，反应过夜。反应结束后，过滤干燥得产物LMGMB。本专利技术提供了一种LMG人工抗原，具有如式(Ⅳ)所示的结构：本专利技术提供了LMG人工抗原的制备方法：LMGMB作为半抗原分别与载体蛋白通过双功能试剂交联法制备得到。所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白质或卵清蛋白；所述透析液为生理盐水或0.01mol/LPBS溶液(pH7.4)。具体地，所述双功能试剂交联法包括如下步骤：S21.将载体蛋白溶于PBS溶液中，记为A液；S22.将双功能试剂溶于N,N-二甲基甲酰胺中，记为B液；S23.在一定温度下磁力搅拌，将B液逐滴加入A液中，反应一段时间后，用透析液透析，得溶液C；S24.将LMGMB半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将此溶液逐滴加入C液中，反应一段时间后，用透析液透析，得到人工抗原。本专利技术还提供了能同时识别AMOZ和LMG的双特异性抗体。所述同时识别呋喃它酮代谢物(AMOZ)和隐孔雀石绿(LMG)的双特异性抗体通过以下步骤制备得到：S31.设计合成AMOZ半抗原和LMG半抗原，并分别将其与载体蛋白偶联，制备AMOZ人工抗原和LMG人工抗原；S32.分别利用AMOZ人工抗原和LMG人工抗原免疫动物，制备能分泌抗AMOZ单克隆抗体的杂交瘤细胞株和抗LMG单克隆抗体的杂交瘤细胞株；S33.采用杂交-杂交瘤技术筛选制备抗AMOZ和LMG的双特异性抗体。其中，S33所述的筛选制备方法，采用杂交-杂交瘤技术，其特征在于首先对S32所述两种杂交瘤细胞株进行酶缺陷型诱导和筛选，用8-氮鸟嘌呤诱导次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型细胞株，用5-溴尿苷或6-氯嘌呤诱导胸苷激酶(TK)缺陷型细胞株。然后将经诱导的酶缺陷型细胞株、经S14或S24所述人工抗原免疫的动物脾细胞按以下组合方式之一进行融合：抗AMOZ的HGPRT酶缺陷型细胞株+经S24人工抗原免疫的动物脾细胞、抗AMOZ的TK酶缺陷型细胞株+经S24人工抗原免疫的动物脾细胞、抗LMG的HGPRT酶缺陷型细胞株+经S14人工抗原免疫的动物脾细胞、抗LMG的TK酶缺陷型细胞株+经S14人工抗原免疫的动物脾细胞、抗AMOZ的HGPRT酶缺陷型细胞株+抗LMG的TK酶缺陷型细胞株、抗AMOZ的TK酶缺陷型细胞株+抗LMG的HGPRT酶缺陷型细胞株，筛选制备抗AMOZ和LMG的双特异性杂交瘤细胞株，然后将双特异性杂交瘤经体内诱导或体外培养制备双特异性抗体。基于上述AMOZ半抗原及人工抗原、LMG半抗原及人工抗原，本专利技术同时还提供了一种同时检测AMOZ、MG及LMG的免疫检测方法，包括以下步骤：S41.分别将AMOZ包被抗原、LMG包被抗原包被在同一酶标板的不同微孔内，孵育、洗板、封闭；S42.分别将AMOZ的标准液、LMG标准液或待测样品液加入酶标板相应微孔内；所述样品液需经还原剂处理，将MG还原为LMG；S43.将抗AMOZ和LMG的双特异性抗体溶液加入酶标板所有微孔内，孵育、洗板；S44.将酶标二抗溶液加入酶标板所有微孔内，孵育、洗板；S45.将显色液加入酶标板所有微孔内，孵育；S46.将终止液加入酶标板所有微孔内，并将酶标板用酶标仪读本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种AMOZ半抗原，其特征在于，其具有如式(I)所示的结构：
【技术特征摘要】
2016.01.07 CN 20161001253831.一种AMOZ半抗原，其特征在于，其具有如式(I)所示的结构：
2.权利要求1所述AMOZ半抗原的制备方法，其特征在于，是将4-巯基苯
甲醛和AMOZ分别溶于无水甲醇中，搅拌过程中将AMOZ的甲醇溶液缓慢滴
加入4-巯基苯甲醛的甲醇溶液中，室温搅拌过夜，反应结束后过滤，分别用蒸
馏水和无水甲醇洗涤，干燥即得。
3.一种AMOZ人工抗原，其特征在于，其具有如式(Ⅱ)所示的结构：
4.权利要求3所述AMOZ人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步
骤：
S11.将载体蛋白溶于PBS溶液中，记为A液；
S12.将双功能试剂溶于N,N-二甲基甲酰胺中，记为B液；
S13.在一定温度下磁力搅拌，将B液逐滴加入A液中，反应一段时间后，
用透析液透析，得溶液C；
S14.将权利要求1所述半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将此溶液逐滴加
入C液中，反应一段时间后，用透析液透析，得到人工抗原；
所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白质或卵清蛋白；所述透析液
为生理盐水或pH7.4的0.01mol/L的PBS溶液。
5.一种LMG半抗原，其特征在于，其具有如式(Ⅲ)所示的结构：
6.权利要求5所述LMG半抗原的制备方法，其特征在于，是将4-巯基苯甲
醛溶于无水甲醇中，向其中加入N,N-二甲基苯胺和催化剂BOP，在氮气保护情
况下加热回流，反应过夜，反应结束后，过滤干燥即得。
7.一种LMG人工抗原，其特征在于，其具有如式(Ⅳ)所示的结构：
8.权利要求7所述LMG人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S21.将载体蛋白溶于PBS溶液中，记为A液；
S22.将双功能试剂溶于N,N-二甲基甲酰胺中，记为B液；
S23.在一定温度下磁力搅拌，将B液逐滴加入A液中，反应一...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖治理，王锋，王弘，沈玉栋，杨金易，孙远明，王宇，戴尽波，刘凤银，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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