本发明专利技术属于纳米功能材料、临床分析及生物电化学传感技术领域，提供了一种同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法及应用。所述传感器使用印刷电极集成3个工作电极，可同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物：癌胚抗原、糖类抗原125及糖类抗原15-3，显著提高了检测效率。该免疫传感器的构建过程简单和超灵敏度的优势对临床早期诊断乳腺癌具有重要的科学意义和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米功能材料、临床分析及生物电化学传感
，提供了一种同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法及应用。
技术介绍
癌症患者的死亡率很高最主要的原因是，不能进行早期诊断，如果能早期诊断及时治疗，1/3的癌症可以治愈。而血清肿瘤标志物的测定对癌症的早期诊断起着重要的作用。因此，建立准确、快速检测血清中肿瘤标志物的分析方法及研制相应的设备引起了人们的高度重视。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，根据有关资料统计，乳腺癌的发病率占全身各种恶性肿瘤的7 10%。它的发病常与遗传有关，它是一种通常发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一，而癌胚抗原(CEA)，糖类抗原125 (CA125)，糖类抗原15-3 (CA15-3)三种肿瘤标志物都与乳腺癌息息相关，三者的联合检测，对乳腺癌的早期诊断具有非常大的意义。 随着近年来纳米技术的快速发展，各种无机纳米材料如碳纳米管、金属纳米粒子、金属氧化物、半导体和石墨烯等已用于电化学免疫传感器的构建。石墨烯(Graphene Sheets, GS)是一种单层、片状的二维结构,近年来成为理论和实践关注的焦点。另外，金属纳米材料由于其独特的性质和优点，如导电性好、催化活性高、比表面积大，而被广泛应用于电化学传感器的增敏方面。其中介孔钼纳米粒子(M-PtNPs))同样具有以上特点，M-PtNPs自身可以与抗体形成化学键一钼氨键，可以牢固地固定抗体，并且M-PtNPs具有很强的催化过氧化氢的能力，自身能产生电信号，非常适合用于传感器的制备。本专利技术制作了三通道丝网印刷电极，首先在三个工作电极上修饰石墨烯，用来连接和固定三种肿瘤标志物的抗体。采用双抗体夹心免疫分析方法，对二抗(Ab2)的标记方法进行了探讨。标记物是用M-PtNPs和Ab2，在底液中加入过氧化氢，从而使免疫传感器的电化学信号得到了有效放大，制备出性能优良、灵敏度高的同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物的多通道电化学免疫传感器。本专利技术采用丝网印刷电极，价格低廉，结合电化学技术，使之具有较高的灵敏度；结合免疫技术，提高了传感器的选择性；仅需简单的样品处理，节省了检测时间，降低了检测成本，是一种快速、廉价且灵敏的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法。本专利技术的目的之二是将所制备的电化学传感器，用于同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物。本专利技术的技术方案，包括以下步骤。1.同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (I)介孔钼纳米粒子(M-PtNPs)的制备 向6 10mL、20 mmol/L的K2PtCl4溶液中，加入聚氧乙烯醚Bri j58使其浓度为8.95 10.95 mmol/L，然后加入6 10 mL、0.1 mmol/L的抗坏血酸溶液，把混合溶液超声1(T15 min，溶液由慢慢地变浑浊，颜色由黄褐色变成棕褐色，最后变成不透明的黑色后，再高速旋转35 45 min，离心分离，用超纯水洗涤数次，然后真空干燥，即得到M-PtNPs。(2)介孔钼纳米粒子标记的乳腺癌肿瘤标志物的二抗标记物(M-PtNPs /Ab2)溶液的制备 将0.5^1.5mg的介孔钼纳米粒子加入lmL、ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液，超声分散后，加入10 μg三种乳腺癌肿瘤标志物的二抗(Ab2)溶液中的一种，混合溶液在4° C下震荡孵化2(T24h，离心分离去除上清液，然后再加入lmL、ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液，得到三种M-PtNPs/Ab2溶液，储存在4° C的冰箱中备用； 所述三种乳腺癌肿瘤标志物的二抗溶液的浓度为5 lOPg/mL。(3)同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法 I)在三通道丝网印刷电极的3个工作电极的表面，分别滴加5 ΙΟμ 、浓度为2mg/mL的石墨烯溶液，室温下自然晾干。 2)在I)中得到的2个工作电极的表面上分别滴加5 10μ 的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液，保持湿润、孵化2 3 h，超纯水清洗，晾干；所述EDC和NHS的浓度均为lmg/mL，EDC和NHS的质量比为1 8:1 ； 3)在2)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5 IOPL三种乳腺癌肿瘤标志物的一抗溶液中的一种，室温下放置f 2h，然后4° C下过夜孵化； 所述三种乳腺癌肿瘤标志物的一抗溶液的浓度为5 10 Pg/mL。4)用超纯水洗去没有交联上的所述的乳腺癌肿瘤标志物的一抗，再滴加质量分数为0.5°/Γ %的牛血清白蛋白溶液，在37° C下放置lh，用ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4° C下储存备用，制得同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物的传感器。2.如上所述的制备的同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器，用于三种乳腺癌肿瘤标志物的同时检测,步骤如下: (I)把已知浓度的三种乳腺癌肿瘤标志物的抗原溶液加入到4(Γ60μ 、ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液中，各取1(T15PL分别滴涂到所制备的传感器的三个工作电极上，放置I h。(2)分别滴涂5 7μ 介孔钼纳米粒子标记的三种M_PtNPs/Ab2溶液到相应的工作电极上，Ih后用ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液洗去未结合上的标记物，得到组装的工作电极。(3)将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入40^60 μ 、5 10 mmol/L H2O2的ρΗ=7.(Γ7.8的PBS缓冲溶液，然后用差分脉冲伏安法检测组装的工作电极的电流响应，根据所得电流响应与三种乳腺癌肿瘤标志物的抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线。(4)将待测样品溶液代替三种乳腺癌肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述三种乳腺癌肿瘤标志物的抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。上述I和2中所述的三种乳腺癌肿瘤标志物选自:癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)和糖类抗原 15-3 (CA15-3)。所述一种同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器，所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。本专利技术具备以下优势: (I)本专利技术快速、准确，可用于三种乳腺癌肿瘤标志物的同时检测。(2)本专利技术采用的介孔钼纳米粒子和石墨烯均可增强电化学信号，从而提高了本专利技术传感器的灵敏度。(3)本专利技术印刷电极制备简单、成本低、便于携带、样品消耗少，易于微型化和集成化，应用范围广。(4)本专利技术与其它的丝网印刷电极传感器相比，可以一次性同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物，显著提高了检测效率，同时具有良好的准确性和精密度，该免疫传感器的研制对临床早期诊断乳腺癌具有重要的科学意义和应用价值。具体实施例方式下面结合实施例进一步说明本专利技术。实施例中所述的三种乳腺癌肿瘤标志物选自:癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)和糖类抗原 15-3 (CA15-3)。实施例1 介孔钼纳米粒子(M-PtNPs)的制备 向6 mL、20 mmol/L的1(2 比14溶液中，加入聚氧乙烯醚Bri j58使其浓度为8.95 mmol/L，然后加入6 mL、0.1 mmol/L的抗坏血酸溶液，把混合溶液超本文档来自技高网...
【技术保护点】
同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法及应用同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）介孔铂纳米粒子（M?PtNPs）的制备向6~10mL、20?mmol/L的K2PtCl4溶液中，加入聚氧乙烯醚Brij58使其浓度为8.95?~?10.95?mmol/L，然后加入6?~?10?mL、0.1?mmol/L的抗坏血酸溶液，把混合溶液超声10?~?15?min，溶液由慢慢地变浑浊，颜色由黄褐色变成棕褐色，最后变成不透明的黑色后，再高速旋转35?~?45?min，离心分离，用超纯水洗涤数次，然后真空干燥，即得到M?PtNPs；（2）介孔铂纳米粒子标记的乳腺癌肿瘤标志物的二抗标记物（M?PtNPs?/Ab2）溶液的制备将0.5?~1.5mg的介孔铂纳米粒子加入1mL、?pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，超声分散后，加入10μg?三种乳腺癌肿瘤标志物的二抗（Ab2）溶液中的一种，混合溶液在4°C下震荡孵化20~24h，离心分离去除上清液，然后再加入1mL?pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，得到三种M?PtNPs/Ab2溶液，储存在4°C的冰箱中备用；（3）同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法1）在三通道丝网印刷电极的3个工作电极的表面，分别滴加5~10?μL、浓度为2?mg/mL的石墨烯溶液，室温下自然晾干；2）在1）中得到的2个工作电极的表面上分别滴加5~10μL的1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亚胺/N?羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）溶液，保持湿润、孵化2~3?h，超纯水清洗，晾干；所述EDC和NHS的浓度均为1mg/mL，EDC和NHS的质量比为1~8?:?1；3）在2）中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5~10?μL三种乳腺癌肿瘤标志物的一抗溶液中的一种，室温下放置1~2?h，然后4°C下过夜孵化；4）用超纯水洗去没有交联上的所述的乳腺癌肿瘤标志物的一抗，再滴加质量分数为0.5%~1%的牛血清白蛋白溶液，在37°C下放置1?h，用pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4°C下储存备用，制得同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物的传感器。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，杜斌，吴丹，张勇，崔振涛，马洪敏，李贺，于海琴，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：
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