本发明专利技术基于氨基化钠基蒙脱石和纳米多孔金膜构建的夹心型电化学免疫传感器，属于功能材料和生物传感技术领域。本发明专利技术通过对钠基蒙脱石进行氨基功能化，使其更有利于固定抗体和酶，同时保持其良好的生物活性；利用纳米多孔金膜良好的三维连续开孔结构及生物相容性，可直接固定一抗，其良好的催化性能又显著提高了传感器的灵敏度；利用廉价、易得的钠基蒙脱石，大大降低了传感器的成本。本发明专利技术能实现多种肿瘤标记物的高灵敏、特异性、快速准确检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备及应用。具体是基于氨基化钠基蒙脱石和纳米多孔金膜构建的夹心型电化学免疫传感器，用于测定多种肿瘤标志物，属于功能材料和生物传感
技术介绍
肿瘤标志物在癌症的早期诊断中具有重要的实用价值。肿瘤标志物是一种在肿瘤细胞的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生、或者由机体对肿瘤细胞的反应而产生的，反应肿瘤存在和生长的一类物质。包括蛋白质、激素、酶、多胺及癌基因产物等。肿瘤标志物在临床中应用广泛，在正常人群中的癌症筛查、有症状者的癌症辅助诊断、癌症的临床阶段的分期、癌症疾病进程的预后评估治疗方案、判断癌症是否复发中起着极其重要的作用。目前临床研究较多的肿瘤标志物有癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、a-L-岩藻糖苷酶(AFU)、前列腺特异性抗原(PSA)、糖类抗原125 (CA-125)、糖类抗原15_3 (CA 15-3)、糖类抗原199(CA-199)、糖类抗原724(CA-724)、糖类抗原242 (CA-242)、人绒毛膜促性腺激素(卢-HCG)、甲状腺球蛋白(TG)。检测肿瘤标志物的方法主要有放射免疫测定法、酶免疫分析测定法、化学发光免疫分析等，这些检测方法具有如下特点 (I)放射免疫测定法该法在生物医学各个领域已得到广泛的应用，其具有操作简便、成本低等优点，但其放射性污染严重，灵敏度低，使其应用受到限制。(2)酶免疫分析测定法该法标记物制备简单，有效期长，对环境无污染等特点，得到了迅速地普及和发展，但因酶容易失活，导致其信号时间短，降低了方法的灵敏度和重现性。(3)化学发光免疫分析测定法该法具有灵敏度高、选择性强、重现性好、易于操作等优点，但其影响化学发光分析检测结果的因素较多，稳定性较差，且在发生化学反应之后，样品的发光无法再现。因此，专利技术一种检测限低、灵敏度高、特异性强、重现性好的肿瘤标志物传感器至关重要。近年来，纳米材料在单分子水平的各种探针技术、纳米集成阵列器件、电极表面修饰等方面的研究取得了突飞猛进的发展参见(a) Lai G. S. ; Yan F. ; Wu J. ; Leng C.;Ju H. X. Anal. Chem., 2011，83，2726-2732. (b) Du D. ; Wang L. M. ; Shao Y. Y. ; WangJ. ; Engelhard M. H. ; Lin Y. H. Anal. Chem. , 2011，83，746-752.。氨基化钠基蒙脱石是一种性能优越的纳米材料，具有比表面积大、孔隙度高、生物相容性好、吸附性能好的特点，氨基化后可实现对一抗良好的结合能力，使之可固载和标记更多生物分子；此外其低廉的价格大大降低了传感器的成本。纳米多孔金膜具有比表面积大、导电性好的特点，加之其良好的生物相容性，可用于修饰电极以增大电极的有效面积，同时可直接固载抗体。本专利技术将以上氨基化钠基蒙脱石和纳米多孔金膜两种纳米材料用于电化学免疫传感器的构建中，赋予电化学免疫传感器更为突出的特色。首先采用纳米多孔金膜固定一抗，由于纳米多孔金膜具有三维连续开孔结构和大的比表面积，有利于固定更多的一抗，而且纳米多孔金膜良好的生物相容性，可以与一抗直接结合，避免了交联剂的使用；然后采用吸附硫堇后的氨基化钠基蒙脱石标记二抗和辣根过氧化物酶，提高了其电极表面的电子传递效率，降低了检测限、增加了传感器的检测灵敏度。按照以上方法制备的电化学免疫传感器，利用钠基蒙脱石具有较大的比表面积和孔隙度、良好的生物相容性，加之氨基化后可实现对一抗良好的结合能力，使之可固载更多抗体和酶。利用纳米多孔金膜良好的三维连续开孔结构及生物相容性，可以直接固定大量肿瘤标志物一抗，同时具有良好的催化活性，能进一步提高电子传递效率等，进而显著改善传感器的灵敏度。经对现有肿瘤标志物检测专利技术的检索发现，目前CN200910212772. 0公开了 一种用于检测甲胎蛋白的电化学发光免疫传感器，该传感器的检测限达到0. 035 ng/mL，线性范围为0.01 20 ng/mL。CN201110199112.0公开了一种检测磷化蛋白的电化学免疫传感器，其检测限为0. 01 ng/mL，线性范围为 0. 02 20 ng/mL。CN03113053. 4公开了一种检测CA-125无试剂安培免疫传感器。本专利技术分别采用纳米多孔金膜和氨基化钠基蒙脱石作为电极修饰和二抗标记材料，降低了传感器的检出限，对多种肿瘤标志物的检测限在3.0 ^3.7 pg/mL之间。由此可以看出，其方法的灵敏度得到显著提高，灵敏度均优于以上三种方法，可以准确定量检测多种肿瘤标志物。本专利技术利用免疫反应的高特异性，结合纳米多孔金膜和氨基化钠基蒙脱石制备了一种夹心型电化学免疫传感器并用来检测多种肿瘤标志物。本专利技术具有灵敏度高、特异性好、检测成本低、能快速检测多种肿瘤标志物等优势，且本专利技术制备过程简单，操作过程简便，有效克服了目前肿瘤标志物检测方法的不足。
技术实现思路
本专利技术的技术任务之一是为了克服现有检测肿瘤标志物技术中的不足，如仪器复杂、成本高、检测过程繁琐等缺点，提供一种高灵敏和特异性的电化学免疫传感器的制备方法，其制备技术成熟可靠； 本专利技术的技术任务之二是提供该电化学免疫传感器的应用，所述电化学免疫传感器能高灵敏、特异性、低成本、快速检测多种肿瘤标志物。 为了实现上述目的，本专利技术是通过以下措施来实现的。1.基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤 (1)纳米多孔金膜的制备； (2)氨基化钠基蒙脱石的制备； (3)基于氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的制备；(4)肿瘤标志物传感器的制备。(I)纳米多孔金膜的制备 1)在25 35°C恒温条件下，将金/银重量比为1:1 1. 2的银金合金薄膜漂浮在1(T15 mol L—1硝酸液面上4 7 min，将银腐蚀掉，制成纳米多孔金膜； 2)将纳米多孔金膜用超纯水洗涤至其pH=7.O。(2)氨基化钠基蒙脱石的制备 1)称取10.00 g蒙脱石，放入大烧杯中，加入100 mL蒸馏水，搅拌2 3 h，置于平稳不受振动的实验台上，静置；待分层后，取出上清液，即为蒙脱石悬浮液；将上述悬浮液加入到250 mL的0.50 mol !/1NaCl溶液中，搅拌12 24 h，静置；分层后，吸出上清液；再加入250 mL的0.50 mol L^1NaCl溶液，搅拌12 h，静置，吸出上清液；将蒙脱石悬浮液在离心机 上以8000 r HiirT1的速度离心12 min，倒掉上清液；重复操作，直至上清液中没有Cl_为止；将洗涤后的试样在烘箱中于70 80°C下干燥，干燥后的试样研成粉末，过100目筛，得到提纯钠化后的蒙脱石； 2)将1.0g钠基蒙脱石转移到80 mL异丙醇和I mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，加热到80°C并持续2 h，使氨基修饰钠基蒙脱石的表面，得到氨基化钠基蒙脱石。(3)基于氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的制备 1)用PH7.0的PBS分散氨基化的钠基蒙脱石(Na-Mont)，形成分散均匀的石墨烯悬浮液； 2)将上述悬浮液与Img mr1的硫堇溶液(TH)混合，37°C下本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于氨基化钠基蒙脱石的肿瘤标志物传感器的制备及应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）纳米多孔金膜的制备；（2）氨基化钠基蒙脱石的制备；（3）基于氨基化钠基蒙脱石标记的二抗的制备；（4）肿瘤标志物传感器的制备。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，杜斌，辛晓东，吴丹，张勇，李贺，王志玲，马洪敏，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：
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