MLH1基因甲基化检测引物探针体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种MLH1基因甲基化检测引物探针体系及其试剂盒，包括用于判定基因组DNA质量的引物探针组X、用于判定甲基化转化率的引物探针组Y和用于检测MLH1基因启动子甲基化情况的引物探针组Z；引物探针组X包括正向引物a、反向引物a和探针a；引物探针组Y包括正向引物b、反向引物b和探针b；引物探针组Z包括正向引物b、反向引物b、探针c和探针d；探针a、探针b和探针c的5’端设有报告荧光基团，探针a、探针b、探针c和探针d的3’端设有淬灭荧光基团。本发明专利技术的试剂盒实施方案简洁，灵敏度高，准确率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系，属于生物

技术介绍
DNA错配修复系统(MMR)是人体细胞的一种能修复DNA碱基错配的安全保障体系，可保持遗传物质的完整性和稳定性。hMLH1、hMSH2、hMSH3是MMR系统中重要的错配修复基因。DNA损伤修复基因的高甲基化引起的表达降低会导致DNA损伤修复能力的下降和随之发生的基因突变。MLH1基因(MutLhomolog1)位于3p21.3，全长2439bp。MLH1基因发生甲基化，会导致这个基因表达失活或是表达的蛋白不能将错配的碱基及时修复，这样就有可能发生抑癌基因失活，癌基因激活，最终会导致肿瘤的发生。大量研究表明，肿瘤组织中的MLH1基因的启动子区域是高度甲基化的。对大肠癌、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、胆囊癌等的研究显示，它们的MLH1基因启动子区域的CpG岛发生甲基化，并且其甲基化程度明显高于正常组织，MLH1基因启动子区域的异常甲基化促进肿瘤的发生和发展。研究还显示MLH1基因甲基化差异与白血病发生及进展恶化显著相关。另外，MLH1基因启动子过度甲基化现象在遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer,HNPCC)中发生率较高，是HNPCC发病的相关因素之一。hMLH1基因的检测对肿瘤诊断、浸润和转移等都具有重要意义。目前，检测甲基化的方法包括：1、甲基化敏感的限制性内切酶(Methylation-sensitiverestrictionEndonuclease，MS-RE)法。但识别的CG序列因酶的识别位点有限故有局限性，且存在酶不完全消化引起的假阳性问题；2、甲基化特异性PCR法(Methylation-specificPCR,MSP)，是目前较为常见的检测基因甲基化的方法。MSP法的原理是首先用亚硫酸盐修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。但是该方法对引物设计要求非常高，一般会因为亚硫酸盐过度的处理，使得模板很难扩增出来。MSP法目前多结合巢式PCR法。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似；第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。MSP法结合巢式PCR扩增的方法是设计针对没有变化的模板的一组引物；针对变化了的模板的一组引物；看哪组引物能扩增出来从而判断模板有没有变化，如果模板没变化，就表示模板被甲基化了。MSP法结合巢式PCR扩增的方法能提高单一MSP法的特异性，但操作时间长，且相比MSP法同样存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置，并且需要反复摸索找出合适的反应时间，造成整个检测过程繁琐，且不能做到定量检测，存在较高的假阳性率；也存在亚硫酸盐处理过度，造成扩增困难的情况；3、甲基化敏感性解链曲线分析法(MS-HighResolutionMeltingCurve，MS-HRM)，操作繁琐，假阳性率高，且不适于大量样本的检测；4、荧光法(Methylight)，由于探针的局限性，一般没有合适的对照体系，假阳性率较高；5、亚硫酸氢盐基因测序法(bisulfitesequencingPCR，BSP)，是PCR联合Sanger测序技术，结果准确，但过程繁琐，不适合大批量检测，且价格昂贵不能广泛使用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种方案简洁，灵敏度高，准确率高的MLH1基因甲基化检测试剂盒，以及其检测引物探针和检测体系。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MLH1基因甲基化检测引物探针，包括用于判定基因组DNA质量的引物探针组X、用于判定甲基化转化率的引物探针组Y和用于检测MLH1基因启动子甲基化情况的引物探针组Z；所述引物探针组X包括正向引物a、反向引物a和探针a；所述引物探针组Y包括正向引物b、反向引物b和探针b；所述引物探针组Z包括正向引物b、反向引物b、探针c和探针d；所述正向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述反向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述正向引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述反向引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；所述探针d的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述探针a、探针b和探针c的5’端设有报告荧光基团，所述探针a、探针b、探针c和探针d的3’端设有淬灭荧光基团。上述各引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4μM；各探针应用于PCR反应中的终浓度为0.2μM。上述探针a、探针b和探针c的5’端设有相互区别的报告荧光基团。上述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或Cy3，第三种是Cy5或ROX；所述淬灭荧光基团是BHQ1。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述引物探针的MLH1基因甲基化检测试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MLH1基因甲基化检测体系，包括用于判定基因组DNA质量的反应体系X、用于判定甲基化转化率的反应体系Y和用于检测MLH1基因启动子甲基化情况的反应体系Z；所述反应体系X包括正向引物a、反向引物a、探针a、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和纯水；所述反应体系Y包括正向引物b、反向引物b、探针b、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和纯水；所述反应体系Z包括正向引物b、反向引物b、探针c、探针d、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和纯水；所述正向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述反向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述正向引物b的核苷酸序列如SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MLH1基因甲基化检测引物探针，其特征在于：包括用于判定基因组DNA质量的引物探针组X、用于判定甲基化转化率的引物探针组Y和用于检测MLH1基因启动子甲基化情况的引物探针组Z；所述引物探针组X包括正向引物a、反向引物a和探针a；所述引物探针组Y包括正向引物b、反向引物b和探针b；所述引物探针组Z包括正向引物b、反向引物b、探针c和探针d；所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述探针d的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述探针a、探针b和探针c的5’端设有报告荧光基团，所述探针a、探针b、探针c和探针d的3’端设有淬灭荧光基团。

【技术特征摘要】
1.一种MLH1基因甲基化检测引物探针，其特征在于：包括用于判定基因组DNA质量的引物探针组X、用于判定甲基化转化率的引物探针组Y和用于检测MLH1基因启动子甲基化情况的引物探针组Z；
所述引物探针组X包括正向引物a、反向引物a和探针a；
所述引物探针组Y包括正向引物b、反向引物b和探针b；
所述引物探针组Z包括正向引物b、反向引物b、探针c和探针d；
所述正向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；
所述反向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；
所述探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；
所述正向引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；
所述反向引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；
所述探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；
所述探针c的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；
所述探针d的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；
所述探针a、探针b和探针c的5’端设有报告荧光基团，所述探针a、探针b、探针c和探针d的3’端设有淬灭荧光基团。
2.根据权利要求1所述的MLH1基因甲基化检测引物探针，其特征在于：各引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4μM；各探针应用于PCR反应中的终浓度为0.2μM。
3.根据权利要求1或2所述的MLH1基因甲基化检测引物探针，其特征在于：所述探针a、探针b和探针c的5’端设有相互区别的报告荧光基团。
4.根据权利要求3所述的MLH1基因甲基化检测引物探针，其特征在于：所述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或Cy3，第三种是Cy5或ROX；所述淬灭荧光基团是BHQ1。
5.一种采用如权利要求1所述的引物探针的MLH1基因甲基化检测试剂盒。
6.一种MLH1基因甲基化检测体系，其特征在于：包括用于判定基因组DNA质量的反应体系X、用于判定甲基化转化率的反应体系Y和用于检测MLH1基因启动子甲基化情况的反应体系Z；
所述反应体系X包括正向引物a、反向引物a、探针a、PCR缓冲液、dNTPs...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐娟娟，赵新泰，王明，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31