检测MYH7基因突变的方法、寡核苷酸及其应用技术

本发明专利技术公开了检测MYH7基因突变的方法、寡核苷酸及其应用，利用所述寡核苷酸可准确地和特异性地检测肥厚性心肌病患者体内MYH7基因突变c.7118C>T是否存在。

【技术实现步骤摘要】
检测MYH7基因突变的方法、寡核苷酸及其应用
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及一种使用PCR及Sanger测序法检测MYH7基因突变的方法、寡核苷酸及其应用。
技术介绍
肥厚型心肌病(HCM)是一种发生率较高，危害人类健康的疾病。其临床表现有黑朦、晕厥、心绞痛、心功能不全和猝死。其中猝死是病程中最严重、最难预料的并发症。在世界范围人群患病率在0.2％左右，中国人群发病人数大约100万人，年死亡率为3％～6％。HCM特点为心脏左心室和(或)右心室及室间隔非对称性肥厚，其发生机制为心肌细胞排列紊乱、心肌纤维化以及心肌缺血等。HCM的发病机制尚不清楚，目前普遍认为是它是一种由于心脏肌节蛋白基因突变引起的常染色体显性遗传病。到目前为止发现的致病基因有13个，其中编码心脏β-肌球蛋白重链(cardiacbeta-myosinheavychain，MYH7)基因为HCM中的最主要的致病基因。MYH7基因位于染色体14q11-12，长23kb，含40个外显子，其中38个外显子编码了1935个氨基酸，其mRNA约3kb。MYH7基因是最早被定位的HCM致病基因，1990年突变R403Q被发现，现在已经陆续发现108种以上突变，其中94％为错义突变，大多发生在MYH7的头部及杆部和结合部位，MYH7基因突变被认为有着相对恶性表型，外显率较高，症状发生较早，预后差，猝死率较高等特点。肥厚性心肌病由于临床表现十分多样，目前确诊主要靠实验室检查。超声心电图目前仍是肥厚性心肌病诊断最常用、最可靠、最经济的诊断方法。另外还有心脏核磁共振、心电图改变等检查方法。但是临床诊断方法不足之处在于被确诊的患者都是已经发展到了发病的中晚期，这对治疗和手术来说都是不利因素。因此，对MYH7基因突变检测来辅助临床诊断具有重要的意义。
技术实现思路
人类MYH7基因的3号外显子野生型序列如SeqNo1所示，其中MYH7基因3号外显子的第197个碱基为C(即SeqNo1中下划线对应的碱基)，就整个人基因组而言，这个碱基对应的位点为7118，故而也称为c.7118C。当利用Sanger测序获得测序结果时，可将所获得的测序结果与SeqNo1进行比较，判断人全血样本中的MYH7基因3号外显子是否发生突变。本专利技术通过5例肥厚型心肌病患者全血样品的3号外显子进行Sanger测序，首次发现2例肥厚型心肌病患者全血样品的碱基c.7118C发生突变，由C变为T，即c.7118C>T，携带这种突变的3号外显子序列如SeqNo2所示。根据现有技术可知，可设计一种包含序列SeqNo2中的10至30个连续核苷酸的寡核苷酸，而且所述连续核苷酸包含序列SeqNo2中的c.7118C>T，这样就利用这种寡核苷酸作为杂交探针或扩增引物来检测这种突变是否发生。另外，也可提取血样样本中的mRNA或者让提取出的mRNA发生逆转录产生cDNA，然后利用这种寡核苷酸与产生的cDNA或提取出的mRNA进行杂交，从而确定这种突变是否存在。当利用荧光定量PCR方法检测这种突变时，这种寡核苷酸可作为探针进行使用，并可根据SeqNo2序列及其附近的内含子序列设计出一对扩增引物，这样就可检测这种突变是否存在。当利用ARMS(突变扩增阻滞系统)-PCR检测这种突变时，这种寡核苷酸就可作为一个扩增引物，然后根据SeqNo2序列及其附近的内含子序列设计出另一个扩增引物和相应的探针，就可检测这种突变是否存在。此外，也可利用比较简单而又成熟的方法，先根据SeqNo2序列及其附近的内含子序列设计一对扩增引物，如本专利技术的MYH7-exon3-F和MYH7-exon3-R对人全血等样本DNA的3号外显子进行扩增，然后利用一对测序引物，如本专利技术的MYH7-SEQ-F和MYH7-SEQ-R，对获得的扩增产物进行Sanger测序，再与SeqNo1序列和SeqNo2序列进行比较，确定这种突变是否存在。本专利技术的目的是提供寡核苷酸，所述寡核苷酸包含一种或多种引物或探针，用于特异性地检测MYH7基因中c.7118C>T突变是否存在。本专利技术的目的是提供用于检测样本MYH7基因突变c.7118C>T的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含序列SeqNo2中的10至30个连续核苷酸，而且所述连续核苷酸包含序列SeqNo2中的c.7118C>T突变位点。本专利技术的目的是提供用于检测样本MYH7基因突变c.7118C>T的寡核苷酸，所述寡核苷酸长至少10个核苷酸，且包括序列SeqNo2中的c.7118C>T突变位点，可与MYH7基因的DNA、cDNA或mRNA杂交。本专利技术的目的是所述寡核苷酸在制造检测样本MYH7基因突变c.7118C>T的试剂盒中的应用。本专利技术的目的是提供用于检测样本MYH7基因突变c.7118C>T的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括一对扩增引物：MYH7-exon3-F和MYH7-exon3-R，其碱基序列为：MYH7-exon3-F：5’-AAGAGGAAGGGACTCACTGGTAA-3’MYH7-exon3-R：5’-GGGAAGACAGAAGGGATATTGG-3’。优选地，所述寡核苷酸还包括一对测序引物：MYH7-SEQ-F和MYH7-SEQ-R，其碱基序列为：MYH7-SEQ-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’MYH7-SEQ-R：5’-AACAGCTATGACCATG-3’。本专利技术的目的是提供一种用于检测样本MYH7基因突变的试剂盒，其包含一种或多种引物或探针，用于特异性地检测MYH7基因中c.7118C>T突变是否存在。本专利技术的目的是还提供一种检测MYH7基因突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测MYH7基因突变是否存在。所述检测MYH7基因突变的引物，包括：一对扩增MYH7基因3号外显子的引物，其碱基序列为：MYH7-exon3-F：5’-AAGAGGAAGGGACTCACTGGTAA-3’MYH7-exon3-R：5’-GGGAAGACAGAAGGGATATTGG-3’。进一步地，还包括一对测序引物，其碱基序列为：MYH7-SEQ-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’MYH7-SEQ-R：5’-AACAGCTATGACCATG-3’。本专利技术的目的是还提供了一种检测MYH7基因突变的方法，包括以下步骤：(1)抽提外周血中的基因组DNA；(2)利用一对扩增引物对步骤(1)中提取出的DNA进行PCR扩增；(3)利用一对测序引物对(2)中的扩增产物进行测序；(4)对测序结果进行判断，确定MYH7基因突变c.7118C>T是否存在，其中所述一对扩增引物的碱基序列为：MYH7-exon3-F：5’-AAGAGGAAGGGACTCACTGGTAA-3’MYH7-exon3-R：5’-GGGAAGACAGAAGGGATATTGG-3’；所述一对测序引物的碱基序列为：MYH7-SEQ-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’MYH7-SEQ-R：5’-AACAGCTATGACCATG-3’。本专利技术的目的还提供一种检测MY本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含一种或多种引物或探针，用于特异性地检测MYH7基因中c.7118C>T突变是否存在。

【技术特征摘要】
1.寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含一种或多种引物或探针，用于特异性地检测MYH7基因中c.7118C>T突变是否存在。2.用于检测样本MYH7基因突变c.7118C>T的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含序列SeqNo2中的10至30个连续核苷酸，而且所述连续核苷酸包含序列SeqNo2中的c.7118C>T突变位点。3.用于检测样本MYH7基因突变c.7118C>T的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸长至少10个核苷酸，且包括序列SeqNo2中的c.7118C>T突变位点，可与MYH7基因的DNA、cDNA或mRNA杂交。4.如权利要求1～3之一所述的寡核苷酸在制造检测样本MYH7基因突变c.7118C>T的试剂盒中的应用。5.用于检测样本MYH7基因突变c.7118C>T的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括一对扩增引物：MYH7-exon3-F和MYH7-exon3-R，其碱基序列为：MYH7-exon3-F：5’-AAGAGGAAGGGACTCACTGGTAA-3’MYH7...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑志高，吴鹏飞，王淑一，
申请(专利权)人：合肥艾迪康临床检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34