一种Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒及检测方法，其中，所述试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，其中高效扩增组包括特异性扩增引物，待扩增的模板序列包含在如序列表SEQ ID NO:1所示的序列中，高效扩增组用于待扩增模板的线性指数PCR扩增；扩增产物退火后经焦磷酸测序组测序，焦磷酸检测组包括：退火引物、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和Klenow酶。本发明专利技术采用本发明专利技术采用线性指数扩增的目标片段扩增方法，精准设计的扩增引物扩增效率高且错配少，直接扩增出单链DNA可直接用于焦磷酸测序，无需对扩增产物进行标记和双链分离，避免了繁冗的实验步骤，也减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤。

A rapid detection kit for Hcy metabolic key enzymes and its detection method

The invention discloses a rapid detection kit and a detection method for key enzymes of Hcy metabolism, wherein the kit is composed of a high-efficiency amplification group and a pyrophosphate sequencing group, wherein the high-efficiency amplification group comprises a specific amplification primer, and the template sequence to be amplified is contained in a sequence as shown in the sequence table SEQ ID NO:1, and the amplification kit is highly efficient. The amplified products were annealed and sequenced by pyrophosphate sequencing group. The pyrophosphate detection group consisted of annealing primers, DNA polymerase, ATP sulfatase, luciferase and Klenow enzyme. The method adopts the target fragment amplification method of linear exponential amplification, and the amplified primers with precise design have high amplification efficiency and few mismatches. The single-stranded DNA can be directly amplified for pyrophosphatic acid sequencing without labeling and double-stranded separation of the amplified products, thus avoiding the tedious experimental steps and reducing the strong alkalinity. The damage of the reagent to the amplified fragment.

【技术实现步骤摘要】
一种Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒及检测方法，属于生物样本检测领域。
技术介绍
同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种人体内的含硫氨基酸，为甲硫氨酸和半胱氨酸代谢过程中的中间产物，其本身并不参与蛋白质的合成，体内不能直接合成Hcy，只能从食物中的甲硫氨酸脱甲基后转变而来。近些年，大量的研究表明，高同型半胱氨酸(hyperhomocysteinemia，HHcy)是导致心脑血管疾病的又一个主要发病因素，升高的血浆同型半胱氨酸和患有高血压的人群中在导致心脑血管疾病上具有协同效果。高同型半胱氨酸血症与一些疾病如脑血管疾病、冠状动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默病等的发病关系越来越多的受到关注。研究表明Hcy水平与心血管事件风险呈正相关，Hcy每升高5μmol/L脑卒中风险升高59％，缺血性心脏病风险升高32％，Hcy每降低5μmol/L脑卒中风险降低24％，缺血性心脏病风险降低16％。调研数据显示，血液Hcy含量升高已成为加速动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子。在正常人体内同型半胱氨酸水平含量不多，影响血液Hcy水平的因素主要有遗传、营养状况、肾功能衰竭、摄入的药物、男女性别、年龄及不良的生活方式等。遗传因素较为重要，因此遗传因素对Hcy代谢的影响也成为日前的研究热点。遗传因素主要是由于Hcy代谢过程中几种关键酶缺陷或基因突变使其活性下降所致。蛋氨酸合成酶(MS)是Hcy在甲基化途径中的关键酶，如果编码MS的基因发生突变，将引起相应的酶缺乏或活性发生改变，从而导致Hcy的代谢异常。MS最常见的突变是第2756位碱基的A/G突变，且可导致血清Hcy水平的改变。因此在以Hcy的血清水平作为众多疾病的判断标准时，如果没有考虑到自身的关键酶突变带来的血清水平改变，则有可能导致Hcy的血清水平存在较大偏差，会干扰检测结果的判断，由此对后续的工作带来很大的影响。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是以蛋氨酸合成酶的基因突变为基础，获得一种Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒及检测方法。为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒的技术方案如下：MS基因突变即2756位A→G导致919位密码子的缺失突变，使编码的天冬氨酸置换为甘氨酸。由于该密码子编码的氨基酸位于酶活性区域，因此该位点突变会通过改变蛋白质的二级结构，使MS活性减弱，从而影响Hcy代谢过程，导致血浆中Hcy处在高水平状态。因此，本专利技术针对MS作为Hcy的代谢关键酶进行试剂盒的研发。本专利技术中的试剂盒所述试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，其中高效扩增组包括特异性扩增引物和线性指数扩增体系，待扩增的模板序列包含在如序列表SEQIDNO:1所示的序列中，高效扩增组用于待扩增模板的线性指数PCR扩增；扩增产物退火后经焦磷酸测序组测序，焦磷酸检测组包括：退火引物、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和Klenow酶。本专利技术根据待测片段的特点，设计出特异性高、准确性好的引物，扩增时采用线性指数PCR(LATE-PCR)可以大量产生便于焦磷酸测序的单链DNA，无需对常规的双链DNA进行解螺旋和分离，简化了检测流程，节约了检测所需的原料及试剂。本试剂盒中的焦磷酸测序组还包括三磷酸腺苷双磷酸酶，当测序组中不含三磷酸腺苷双磷酸酶时，检测后的发光不会被消耗，因此发光值会发生叠加，这种检测方式虽然简便但检测的准确度低，因此优选的酶系还包括三磷酸腺苷双磷酸酶，进行传统的焦磷酸出峰式检测，便于机器识读及分型。引物序列中有一条为过量引物，一条为限制性引物，过量引物和限制性引物与正向引物和反向引物之间并无明确的制定关系，可以根据需要扩增的片段单链来选择扩增量，扩增量大的链对应的扩增引物即为过量引物，另一条链对应的扩增引物为限制性引物。设计引物时，由于线性指数PCR对于引物的要求较高，要求引物之间的Tm值之差≥5℃，扩增产物与过量引物之间的Tm值之差≤13～18℃。这样可以保证最佳的延伸效果，但该温度要求不是绝对的，只要能够通过LATE-PCR扩增出待测的目的产物，就可以采用。优选的，本专利技术中如序列表SEQIDNO：2所示的引物为过量引物，如序列表SEQIDNO：3所示的引物为限制性引物。本专利技术中过量引物与限制性引物的具体选择可以根据实际需要扩增的单链进行调换，也就是说，如序列表SEQIDNO：2所示的引物为限制性引物，如序列表SEQIDNO：3所示的引物为过量引物。引物的用量可以根据实际需要和本领域常识进行调整，用量多的一条引物为过量引物，用量少的一条引物为限制性引物，本专利技术的保护范围不应受到引物名称和使用量的限制。更优选的，过量引物与限制性引物在体系中的添加量为指数倍，最少为10倍。优选的，扩增试剂还包括扩增缓冲液、dNTPs和Mg2+。本专利技术中的扩增产物优选采用焦磷酸测序进行序列检测，焦磷酸测序引物优选如序列表SEQIDNO：4所示。但焦磷酸测序并不是唯一的测序方式，任何的可以检测基因序列的现有技术均可以作为检测方法被本专利技术采用，因此，焦磷酸测序不应作为是对本专利技术的限制。本专利技术的第二个目的在于提供一种采用上述任一一款试剂盒的扩增方法，所述方法包括如下步骤：a)提取DNA样本；b)以提取出的DNA样本为模板，利用如序列表SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的扩增引物，进行线性指数PCR扩增；c)将扩增产物进行退火处理，退火引物如序列表SEQIDNO：4所示，制备单链模板；d)将制备好的单链模板进行焦磷酸测序，确定SNP位点的基因型。所述扩增体系采用25μL体系，具体为：1×PCRbuffer、3mmol/LMgCl2、100μmol/LdNTPs、1.5UTaqDNA聚合酶、0.1μmol/L限制性引物PL、1μmol/L过量引物PE，13％甘油和4％BSA2mmol/L；1μLDNA模板，加水补充至25μL。扩增条件为95℃预变性5min，60℃扩增循环，72℃延伸10min，4℃保持，其中每87℃10s、66℃10s和72℃20s组成一个扩增循环。扩增后优选采用焦磷酸测序，虽然扩增后的产物大部分为单链，但仍有部分区域为双链，为了使焦磷酸检测根据准确和快速，仍对扩增产物进行退火处理，制备为单链模板。优选的，退火处理时采用两种试剂：试剂A为不含Apyrase的其他焦磷酸测序用试剂，包括DTT、APS、PVP、ATPsulfurylase、Klenow、荧光素和荧光素酶，试剂B为试剂A与Apyrase的混合液。其中，试剂A的一种最优选的配置方案是：0.1mol/LTris-醋酸(pH7.7)，2mmol/LEDTA，10mmol/L醋酸镁，0.1％BSA，1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，2μmol/LAPS，0.4g/LPVP，200U/LATPsulfurylase，18U/mLKlenow，0.8mmol/LD-荧光素，6mg/L荧光素酶。试剂B最优选的一种配置方案是：试剂A与3.2U/mLApyrase的混合液。退火时，取1～2μLLATE-PCR产物和1.2μLAPS(1mmol/L)，加入30μL试剂A，混匀后放置10～15min，再加40μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，其中高效扩增组包括特异性扩增引物和线性指数扩增体系，待扩增的模板序列包含在如序列表SEQ ID NO:1所示的序列中，高效扩增组用于待扩增模板的线性指数PCR扩增；扩增产物退火后经焦磷酸测序组测序，焦磷酸检测组由退火引物、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和Klenow酶组成。

【技术特征摘要】
1.一种Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，其中高效扩增组包括特异性扩增引物和线性指数扩增体系，待扩增的模板序列包含在如序列表SEQIDNO:1所示的序列中，高效扩增组用于待扩增模板的线性指数PCR扩增；扩增产物退火后经焦磷酸测序组测序，焦磷酸检测组由退火引物、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和Klenow酶组成。2.根据权利要求1所述的Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒，其特征在于：所述焦磷酸测序组还包括三磷酸腺苷双磷酸酶。3.根据权利要求1所述的Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒，其特征在于：特异性扩增引物序列上游序列如序列表SEQIDNO：2所示，下游序列如序列表SEQIDNO：3所示。4.根据权利要求1所述的Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒，其特征在于：退火引物序列如序列表SEQIDNO：4所示。5.根据权利要求3所述的Hcy代谢关键酶的快速检测试剂盒，其特征在于：特异性引物的加入量不等。6.根据权利要求5所述的Hcy代谢关键酶的快速检...

【专利技术属性】
技术研发人员：王花，孙力强，孙正扬，孙正明，
申请(专利权)人：新开源云扬广州医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44