一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，它包括：1）培养无菌种苗；2）接种叶片外植体，获得愈伤组织和再生植株；3）将供体植株及叶再生植株驯化移栽；4）提取愈伤组织、移栽和未移栽供体植株叶片、移栽和未移栽再生植株叶片的DNA；5）分别采用EcoRⅠ联合MspⅠ或者HpaⅡ对提取的各类DNA进行双酶切，并连接双链接头；6）预PCR扩增反应；7）选择性PCR扩增反应；8）毛细管电泳；9）统计分析，筛选出黑果枸杞叶片再生相关的MSAP位点；10）特异性条带的回收、测序和分析；本发明专利技术可迅速筛选出叶片再生相关MSAP位点，且与移栽驯化无关；这类位点的挖掘对最终揭示木本植物叶片脱分化和再分化机理有重要意义，丰富了植物表观遗传学内容。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法
本专利技术属于植物表观遗传学领域，具体涉及一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法。
技术介绍
黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr.）为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木，是一种盐生药用植物，重要的生态经济型树种。在我国，黑果枸杞主要分布在宁夏、山西、甘肃、青海、新疆、西藏等省区。黑果枸杞中含有多种人体必需的氨基酸和微量元素，可提高人体免疫能力；黑果枸杞被称为原花青素之王，其原花青素具有清除自由基、增强免疫力、延长果蝇寿命、降低小鼠血清总胆固醇和甘油三脂、升高血清、肝组织和机体总抗氧化能力等功效；从果汁中提取的黑果枸杞色素稳定性好、着色力强，是国内急需的理想食用天然花色甙，不但可应用于药品和食品中，还可作为天然染料应用于轻纺工业。同时，黑果枸杞具有抗旱、抗寒、耐盐碱、根蘖性强和耐土壤贫瘠等诸多优点，是盐碱地治理、护坡、防止水土流失的良好树种。我们前期研究建立了稳定高效的黑果枸杞离体快速繁殖方法，包括以叶片为外植体的直接和间接器官发生，表明黑果枸杞是研究木本植物叶片脱分化和再分化机理的理想实验材料。植物组织培养在林业上具有广泛的应用和更加重要的意义。愈伤组织阶段能抹除外植体原有的年龄痕迹，从而使植物材料“返老还童”。因此，经过愈伤组织阶段产生的再生植株通常具备较小的生理年龄而更符合造林需求。但是木本植物外植体脱分化形成愈伤组织的分子机理目前尚不清楚，这限制了木本植物离体再生体系的建立和应用。已有研究证明黑果枸杞是探索木本植物叶片脱分化机理的理想实验材料。本专利技术在前期研究的基础上，筛选出非常稳定的愈伤特异性MSAP（甲基化敏感的扩增片段长度多态性）位点。对位点相关基因的进一步研究，可为建立更加理想的黑果枸杞再生体系打下基础，为攻克其它木本植物的“组培难”问题和保护濒危珍贵种质资源提供理论依据，为木本植物的分子育种奠定基础。此外，叶片脱分化表观遗传机理的研究可以丰富树木表观遗传学理论、植物细胞全能性理论、基因表达调控理论等。甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术，用于测定DNA甲基化程度，这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用。这项技术是在AFLP分子标记技术的基础上衍生出来的，是基于PCR扩增的DNA甲基化多态性的检测方法，即将标准的AFLP分子标记分析中使用的高频酶MseI，替换成了一对同裂酶HpaII和MspI，而此对同列酶对甲基化识别位点敏感性不同，而其余操作与AFLP完全一样。主要操作步骤包括基因组DNA双酶切、人工接头连接、MSAP预扩增反应、MSAP选择性扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳、条带统计分析等。MSAP可以检测在DNA序列没有发生变化时，基因组DNA的甲基化修饰水平，又能够对DNA特异性位点的甲基化状态进行检测。MSAP技术相对其他测定DNA甲基化程度的技术有如下优点：(1)不需知道被测DNA的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于DNA序列背景知识未知的生物；(2)操作相对简便，在AFLP技术体系的基础无需改进，即可操作；(3)可在全基因组范围检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化；（4）MSAP技术的引物设计简单。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种有效且低成本的筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法。一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）培养无菌种苗；2）接种叶片外植体，获得愈伤组织和再生植株；3）将供体植株及叶再生植株驯化移栽；4）提取愈伤组织、移栽和未移栽供体植株叶片、移栽和未移栽再生植株叶片的DNA；5）分别采用EcoRⅠ联合MspⅠ或者HpaⅡ对提取的各类DNA进行双酶切，并连接双链接头；6）预PCR扩增反应；7）选择性PCR扩增反应；8）毛细管电泳；9）统计分析，筛选出愈伤组织特异性的MSAP位点，即黑果枸杞叶片再生相关的MSAP位点；10）特异性条带的回收、测序和分析；步骤5）中所述的双酶切，反应体系为：反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ）：BSA（10mg/L）1μLH/Madaptor（25μM）1μLEcoRⅠadaptor（2.5μM）1μLEcoRⅠ（20U/μL）0.15μLHpaⅡ（10U/μL）0.3μLDNA150ng加去离子水补足到总反应体积为20μL；反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ）：BSA（10mg/L）1μLH/Madaptor（25μM）1μLEcoRⅠadaptor（2.5μM）1μLEcoRⅠ（20U/μL）0.15μLMspⅠ（20U/μL）0.15μLDNA150ng加去离子水补足到总反应体积为20μL；将混匀的体系，在37℃进行DNA酶切6h之后，每个反应体系添加T4ligase0.1μL，混匀后在8℃下进行接头连接4h；步骤5）中所述的双链接头，是先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50μM后等量混合；后将混合接头煮沸5min，冷却后得到；步骤6）中预PCR扩增反应体系为：10×PCRreactionbuffer2.5μldNTPs（10mM）0.5μlEcoRⅠadaptor+A（5μM）1μlH/Madaptor+0（5μM）1μlTaqDNApolymerase（5U/μl）0.2μlPCRwater17.8μlDNA模板（酶切连接产物稀释20倍后）2μlTotalvolume25μl；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30S，56℃复性30s，72℃延伸60S，共进行30个循环，最后72℃延伸10min；用0.1×TEbuffer稀释预扩增产物5-20倍；步骤7）中选择性PCR扩增反应体系为：10×PCRreactionbuffer1.5μldNTPs（2.5mM）0.15μlEcoRⅠprimer（5μM）0.6μlH/Mprimer（5μM）0.6μlTaqDNApolymerase（5U/μl)0.2μlPCRwater9.95μlDNA模板（预扩增稀释产物）2μlTotalvolume15μl；混匀体系，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30S，65℃复性30S，72℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着95℃变性30S，56℃复性30S，72℃延伸80S，共进行30个循环，最后72℃延伸10min；步骤7）所述的选择性PCR扩增，引物对如下：EcoRⅠ引物5’端分别用F6-羧基荧光素（FAM）、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素琥珀酰亚胺（HEX）或TAMARA等进行标记。本专利技术提供了一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，它包括：1）培养无菌种苗；2）接种叶片外植体，获得愈伤组织和再生植株；3）将供体植株及叶再生植株驯化移栽；4）提取愈伤组织、移栽和未移栽供体植株叶片、移栽和未移栽再生植株叶片的DNA；5）分别采用EcoRⅠ联合MspⅠ或者HpaⅡ对提取的各类DNA进行双酶切，并连接双链接头；6）预PCR扩增反应；7）选择性PCR扩增反应；8）毛细管电泳；9）统计分析，筛选出黑果枸杞叶片再生相关的MSAP位点；10）特异性条带的回收、测序和分析；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）培养无菌种苗；2）接种叶片外植体，获得愈伤组织和再生植株；3）将供体植株及叶再生植株驯化移栽；4）提取愈伤组织、移栽和未移栽供体植株叶片、移栽和未移栽再生植株叶片的DNA；5）分别采用EcoRⅠ联合MspⅠ或者HpaⅡ对提取的各类DNA进行双酶切，并连接双链接头；6）预PCR扩增反应；7）选择性PCR扩增反应；8）毛细管电泳；9）统计分析，筛选出愈伤组织特异性的MSAP位点，即黑果枸杞叶片再生相关的MSAP位点；10）特异性条带的回收、测序和分析。

【技术特征摘要】
1.一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）培养无菌种苗；2）接种叶片外植体，获得愈伤组织和再生植株；3）将供体植株及叶再生植株驯化移栽；4）提取愈伤组织、移栽和未移栽供体植株叶片、移栽和未移栽再生植株叶片的DNA；5）分别采用EcoRⅠ联合MspⅠ或者HpaⅡ对提取的各类DNA进行双酶切，并连接双链接头；6）预PCR扩增反应；7）选择性PCR扩增反应；8）毛细管电泳；9）统计分析，筛选出愈伤组织特异性的MSAP位点，即黑果枸杞叶片再生相关的MSAP位点；10）特异性条带的回收、测序和分析。2.根据权利要求1所述的一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤5）中所述的双酶切，反应体系为：反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ）：BSA（10mg/L）1μLH/Madaptor（25μM）1μLEcoRⅠadaptor（2.5μM）1μLEcoRⅠ（20U/μL）0.15μLHpaⅡ（10U/μL）0.3μLDNA150ng加去离子水补足到总反应体积为20μL；反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ）：BSA（10mg/L）1μLH/Madaptor（25μM）1μLEcoRⅠadaptor（2.5μM）1μLEcoRⅠ（20U/μL）0.15μLMspⅠ（20U/μL）0.15μLDNA150ng加去离子水补足到总反应体积为20μL；将混匀的体系，在37℃进行DNA酶切6h之后，每个反应体系添加T4ligase0.1μL，混匀后在8℃下进行接头连接4h。3.根据权利要求2所述的一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤5）中所述的双链接头，是先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50μM后等量混合；后将混合接头煮沸5min，冷却后得到。4.根据权利要求3所述的一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤6）中预PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：王钦美，王皓，崔进，崔建国，李娜，林梅，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21