基因分型检测的试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于分子生物学基因多态性检测技术领域，具体涉及一种基因分型检测的试剂盒及方法。所述试剂盒包括针对ADH1B基因rs1229984位点的第一引物对和第一分子信标探针，针对ALDH2基因rs671位点的第二引物对和第二分子信标探针，针对CYP1A2基因rs762551位点的第三引物对和第三分子信标探针，针对TMPRSS6基因rs855791位点的第四引物对和第四分子信标探针。利用本发明专利技术试剂盒可以快速、简便地检测四种对应基因的基因型及对应的代谢吸收类型。

【技术实现步骤摘要】
基因分型检测的试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学基因多态性检测
，具体涉及一种基因分型检测的试剂盒及方法。
技术介绍
酒精，也就是乙醇，在人体内的代谢过程主要发生在肝脏，乙醇首先通过乙醇脱氢酶转化为乙醛，乙醛通过乙醛脱氢酶转化为乙酸。乙醛对人体的伤害非常大，是酒精中毒的罪魁祸首，对人体内的各个器官伤害极大，而乙酸对人体基本没有伤害。酒精代谢过程中，乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶是其主要限速酶，代谢的速度快慢直接导致了乙醛在人体内停留的时间长短，也就是对人体伤害的程度大小，而限速酶的活性强弱因人而异，这与编码乙醇脱氢酶的ADH1B基因和乙醛脱氢酶的ALDH2基因的多态性密切相关。ADH1B基因rs1229984位点位点是TT基因型的人群能使乙醇脱氢酶活性变高，乙醇转化为乙醛的代谢加快，同时能够分解与乙醇结构类似的存在于酒精中的毒素，而CC基因型的人群则乙醇脱氢酶活性低，喝进去的乙醇转化为乙醛的速度很慢，表现为酒气大，CT基因型的人群酶活性则正常，代谢正常。ALDH2基因rs671位点是AA和AG基因型的人群，乙醛脱氢酶活性较低，将乙醛代谢为乙酸的速度极慢，而GG基因型的人群，乙醛脱氢酶活性高，酒精代谢能力强。因此，检测这两个基因的型别是一件很有意义的事情，可以知道自己对酒精代谢的快慢，从而知道自己是否适合喝酒，避免发生酒精中毒等对自身身体损伤的事件。咖啡因是从茶叶、咖啡果中提取出来的一种生物碱。某些人摄入的咖啡因能很快从体内清除出，不能令人产生特别明显的兴奋感；而对于另外一些人，咖啡因在体内的清除速度很慢，起作用时间也就较长，往往一杯咖啡就会令他们夜不能寐，有的还会影响食欲，呕吐和痉挛；这种现象与咖啡因代谢快慢有关，而CYP1A2基因是参与咖啡因初级代谢过程的主要代谢酶，是细胞色素P450氧化酶的一个亚家族，约占肝脏CYP450s酶含量的13％。研究发现，该位点是AA基因型的人群，其CYP1A2酶活性高，咖啡因代谢快；AC和CC基因型的人群，其CYP1A2酶活性低，咖啡因代谢慢。还有一些研究表明，咖啡因在人体内的积累量与患心血管疾病的风险相关。因此检测咖啡因代谢能力也是一件很有意义的事情。铁是人体内含量最丰富的一种必需元素，存在于所有细胞内。在体内主要参与血红蛋白的合成和氧的输送。铁代谢平衡被破坏会导致人体铁缺乏或铁过载。铁缺乏可以引起缺铁性贫血，铁过载可以引起血色病。TMPRSS6基因编码跨膜丝氨酸蛋白酶S6，在正常生理情况下，跨膜丝氨酸蛋白酶6通过体内一系列的信号转导通路抑制Hamp基因的表达，跨膜丝氨酸蛋白酶6活性降低，则体内铁调素含量增高。Hamp是编码铁调素的基因，铁调素是调控小肠上皮细胞铁泵蛋白吸收铁离子的关键分子，当铁调素水平上升时，血清铁水平就会下降，引起缺铁性贫血。研究发现，TMPRSS6基因上的rs855791位点突变(AA基因型)，导致TMPRSS6蛋白酶活性降低，潜在影响了铁调素的过多分泌，从而抑制了机体铁的吸收和动员，最终增加人体患铁缺乏或缺铁性贫血的风险。因此检测人体铁的吸收代谢能力也是一件很有意义的事情。目前市场上有对ALDH2基因和ADH1B基因检测的试剂盒，有CYP1A2基因检测的试剂盒，也有TMPRSS6基因检测试剂盒。但是方法不一，最多的是基因芯片法，基因芯片法最大的优点是通量大，但是有成本比荧光定量PCR法高，且操作复杂耗时长，有非特异性信号，灵敏度和重复性较差的缺点。还有各种PCR法，如Taqman探针水解法，其最大的优点是准确性高，设计简单，但是成本较高，但检测1个SNP至少需要两条探针、两种荧光基团，对检测通道有限制。大部分的荧光定量PCR仪只能同时检测5个通道，Taq-Man探针针水解法只能同时检测2个SNP，检测通量小。另外，有中国专利申请CN2017010622578.4公开了一种分子信标法检测ALDH2基因rs671的快速检测方法，其淬灭剂为非荧光淬灭剂，且要进行MGB修饰，且检测rs671的两个等位基因用了2条分子信标探针，成本极高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种基因分型检测的试剂盒及方法，旨在解决现有同时检测人的ADH1B、ALDH2、CYP1A2和TMPRSS6四个基因的基因型的成本高、操作繁琐的技术问题。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术一方面提供一种基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括针对ADH1B基因rs1229984位点的第一引物对和第一分子信标探针，针对ALDH2基因rs671位点的第二引物对和第二分子信标探针，针对CYP1A2基因rs762551位点的第三引物对和第三分子信标探针，针对TMPRSS6基因rs855791位点的第四引物对和第四分子信标探针；其中，所述第一引物对的核酸序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，所述第一分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO：3，所述第二引物对的核酸序列为SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，所述第二子信标探针的核酸序列为SEQIDNO：6，所述第三引物对的核酸序列为SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，所述第三分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO：9，所述第四引物对的核酸序列为SEQIDNO：10和SEQIDNO：11，所述第四分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO：12；所述第一分子信标探针、第二分子信标探针、第三分子信标探针和第四分子信标探针的5'端连接有荧光报告分子、且3'端连接有猝灭剂。本专利技术另一方面提供一种基因分型检测的方法，包括如下步骤：提取样本DNA；将所述样本DNA与本专利技术的上述试剂盒中的试剂混合，进行多重荧光定量PCR扩增，得到溶解曲线的Tm值；根据所述Tm值，判断所述样本DNA中的ADH1B、ALDH2、CYP1A2和TMPRSS6的基因型。本专利技术的试剂盒旨在针对人体酒精代谢(对应ADH1B和ALDH2基因)、咖啡因代谢(对应CYP1A2基因)和铁吸收(对应TMPRSS6基因)的相关基因分型的检测，该试剂盒选用分子信标探针熔解曲线法来进行分型检测，与基因芯片法相比操作简单耗时短，灵敏度高且重复性好，与Taqman探针水解法相比，1个SNP位点只需要设计1条分子信标探针，省了一倍的成本；利用本专利技术试剂盒可以快速、简便地检测四种对应基因的基因型及对应的代谢吸收类型。本专利技术提供的基因分型检测的方法利用本专利技术的特有的试剂盒进行检测，该方法中通过用多重不对称PCR技术，利用试剂盒中设计的互不影响的4对引物和4条分子信标探针，经过多次调试序列和引物探针浓度比例，优化PCR扩增条件，克服了各个困难，最终成功研发了只需一管试剂便能同时检测这4个基因分型的方法，大大增加了检测的通量和节约了成本。附图说明图1为本专利技术的试剂盒对人ADH1B基因rs1229984位点的熔解曲线检测结果图；图2为本专利技术的试剂盒对人ALDH2基因rs671位点的熔解曲线检测结果图；图3为本专利技术的试剂盒对人CYP1A2基因rs762551位点的熔解曲线检测结果图；图4为本专利技术的试剂盒对人TMPRSS6基因rs855791位点的熔解曲线检测结果图；图5为本专利技术实施例2中样本JYH的熔解曲线检测结果图；图6为本专利技术实施例2中阳性对照品的熔解曲线检测结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因分型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对ADH1B基因rs1229984位点的第一引物对和第一分子信标探针，针对ALDH2基因rs671位点的第二引物对和第二分子信标探针，针对CYP1A2基因rs762551位点的第三引物对和第三分子信标探针，针对TMPRSS6基因rs855791位点的第四引物对和第四分子信标探针；其中，所述第一引物对的核酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述第一分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO：3，所述第二引物对的核酸序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，所述第二子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO：6，所述第三引物对的核酸序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，所述第三分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO：9，所述第四引物对的核酸序列为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，所述第四分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO：12；所述第一分子信标探针、第二分子信标探针、第三分子信标探针和第四分子信标探针的5'端连接有荧光报告分子、且3'端连接有猝灭剂。

【技术特征摘要】
1.一种基因分型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对ADH1B基因rs1229984位点的第一引物对和第一分子信标探针，针对ALDH2基因rs671位点的第二引物对和第二分子信标探针，针对CYP1A2基因rs762551位点的第三引物对和第三分子信标探针，针对TMPRSS6基因rs855791位点的第四引物对和第四分子信标探针；其中，所述第一引物对的核酸序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，所述第一分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO：3，所述第二引物对的核酸序列为SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，所述第二子信标探针的核酸序列为SEQIDNO：6，所述第三引物对的核酸序列为SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，所述第三分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO：9，所述第四引物对的核酸序列为SEQIDNO：10和SEQIDNO：11，所述第四分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO：12；所述第一分子信标探针、第二分子信标探针、第三分子信标探针和第四分子信标探针的5'端连接有荧光报告分子、且3'端连接有猝灭剂。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告分子包括HEX、TexasRed、Cy5和FAM中的至少一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宇亮，李科铮，钟宇萍，陈婷，李婵，杨勇，迟海滨，
申请(专利权)人：深圳鼎新融合科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44