一种高灵敏的突变位点检测体系、方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种高灵敏的基因突变检测体系、方法及应用，包括：设计针对野生型基因的野生型上游或下游引物、针对突变型基因的突变型上游或下游引物、通用的上游或下游引物、突变型blocker和野生型blocker；采用双管PCR体系进行PCR反应，对样本进行定量PCR检测；其中，一管包括野生型引物、突变型blocker和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker和通用引物。本发明专利技术的高灵敏的基因突变检测方法，通过特异性引物合并特异性blocker的方法，提高了检测的特异性和灵敏度；本发明专利技术通过标准品以及标准曲线的绘制，很好的避免了假阳性和假阴性结果；本发明专利技术具有检测万分之一及其以上基因突变的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏的突变位点检测体系、方法及应用
本专利技术涉及生物医学领域，特别涉及一种高灵敏的基因突变检测体系、方法和应用。
技术介绍
基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，如单核苷酸多态性(SNPs)以及未甲基化的核苷酸被转化后碱基的变化。单核苷酸多态性即SNPs是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A，G，C，T)替换而引起的多态性，是新一代多态性遗传标记。SNPs在生物基因组中广泛存在，如人类30亿个碱基中每千个碱基出现一次，在整个基因组共有300万以上的SNPs。SNPs和疾病的发生发展密切相关。细胞基因的甲基化和肿瘤的发生、发展密切相关，非甲基化的胞嘧啶(C)在亚硫酸氢盐作用下转化为尿嘧啶(U)，从而成为具有检测价值的突变位点。目前市面上针对基因突变检测的方法有许多，包括一代测序、二代测序，基因芯片、荧光定量PCR(qPCR)技术等。但是在较高的野生型模板的背景下，针对稀有的基因突变的检测能力有限。稀有基因突变，指的是存在大量野生基因序列背景中的极为稀少的基因序列。在癌症病人或是治疗后病人血液中含有少量的肿瘤突变DNA(ct-DNA)以及含有甲基化位点的DNA；孕妇外周血含有少量的胎儿DNA等，这些情况都属于大量野生型背景下的稀有基因检测。许多引起肿瘤的体细胞突变都是掺杂在野生型细胞内的，所提的DNA也是带有大量野生型DNA，同样需要采用稀有基因突变的检测方法。因此，稀有基因突变的检测在癌症筛查和预后跟踪、无创产前筛查等具有十分重要的意义。和测序技术检测基因突变相比，qPCR技术具有迅速、方便、价格低等优点，可以做到对基因突变的高灵敏检测。评价基因突变检测方法的优劣包括：灵敏度、特异性、简便程度等。灵敏度是指在大量野生型DNA背景下能够检测到的最小突变型的量；特异性是指不被检测到的最大突变型的量。基于PCR技术的稀有基因突变检测方法可以归为两类：(1)特异性引物扩增方法；(2)非特异性引物加特异性blockers的方法.第一类的特异性引物扩增的方法有ARMS(amplificationrefractorymutationsystem),ASB-PCR(allele-specificblockerPCR),以及castPCR(competitiveallelespecificTaqManPCR)。第二类方法包括PNAblockerPCR和COLD-PCR(co-amplificationatlowerdenaturationtemperaturePCR)等.以上的方法具有高灵敏检测基因突变的能力，但是需要碱基的修饰、特殊的反应试剂或特殊的反应程序等，因此有必要研发一种简单的、灵敏度更高的检测方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种高灵敏的基因突变检测体系、方法及应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于qPCR技术的特异性引物合并特异性blocker的检测方法ASPB(allele-specificprimerandblocker)即高灵敏的基因突变检测体系、方法及应用，具有较高的检测灵敏度和特异性。检测突变型模板时，特异性引物与突变型模板互补配对，而与野生型不互补，特异性blocker引物与野生型模板互补对扩增抑制大而与突变型模板不互补对扩增抑制小，使得突变型模板得到扩增，而野生型模板的扩增得到抑制，从而起到了高灵敏检测基因突变的目的。与标准品曲线对比，可以确定基因突变的频率和拷贝数，很好的避免了假阳性和假阴性。本方法可以检测万分之一及以上的基因突变，灵敏度高，使用方便。本专利技术采用的技术方案是：一种高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，包括：针对野生型基因的野生型引物、针对突变型基因的突变型引物、通用引物、突变型blocker引物和野生型blocker引物；野生型引物为野生型上游引物或野生型下游引物；突变型引物为突变型上游引物或突变型下游引物；通用引物为通用上游引物或通用下游引物；所述的基因突变检测体系为双管PCR体系，其中一管包括野生型引物、突变型blocker引物和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker引物和通用引物。优选地，所述野生型引物和野生型模板互补，所述突变型引物和突变型模板互补；所述野生型引物和突变型引物的3’端的末端碱基或在引物序列中间的一个碱基不同，其它序列相同；所述野生型引物和突变型引物的长度为15-35个碱基。优选地，所述通用引物分别和所述野生型模板、突变型模板互补，其长度为15-35个碱基。优选地，所述野生型blocker引物和野生型模板互补，所述突变型blocker引物和突变型模板互补；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的5’端的末端碱基不同或由5’端到引物序列中间所组成的序列片段的一个碱基不同，而其它序列相同；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的长度为15-40个碱基；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物不可以发生扩增，所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的3’端被修饰基团修饰或3’端有若干个和所述野生型模板、突变型模板均不互补的碱基。优选地，所述的通用上游引物选自5’-ACCAGTTGGGCATGTTGA-3’SEQIDNO：1；5’-AGCATTGGAATCCAGAAACCAG-3’SEQIDNO：2；5’-GAATCCAGAAACCAGTTGGGC-3’SEQIDNO：3；5’-TCTCCCTCCCTCCAGGAAGC-3’SEQIDNO：4；5’-GACCGTCGCTTGGTGCA-3’SEQIDNO：5；5’-TACTTGGAGGACCGTCGCT-3’SEQIDNO：6；5’-AGGGCATGAACTACTTGG-3’SEQIDNO：7；野生型下游引物选自：5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’SEQIDNO：8；5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’SEQIDNO：9；5’-GCACCCAGCAGTTTGGCCG-3’SEQIDNO：10；5’-CGAAGGGCATGAGCTGCG-3’SEQIDNO：11；突变型blocker引物选自：5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATC-3’SEQIDNO：12；5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTAC-3’SEQIDNO：13；5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’SEQIDNO：14；5’-ATGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAG-3’SEQIDNO：15；每一个突变型blocker引物的3’端采用磷酸化修饰；突变型下游引物选自：5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATG-3’SEQIDNO：16；5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’SEQIDNO：17；5’-GCACCCAGCAGTTTGGCCG-3’SEQIDNO：18；5’-CGAAGGGCATGAGCTGCA-3’SEQIDNO：19；野生型blocker引物选自：5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，包括：针对野生型基因的野生型引物、针对突变型基因的突变型引物、通用引物、突变型blocker引物和野生型blocker引物；野生型引物为野生型上游引物或野生型下游引物；突变型引物为突变型上游引物或突变型下游引物；通用引物为通用上游引物或通用下游引物；所述的基因突变检测体系为双管PCR体系，其中一管包括野生型引物、突变型blocker引物和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker引物和通用引物。

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，包括：针对野生型基因的野生型引物、针对突变型基因的突变型引物、通用引物、突变型blocker引物和野生型blocker引物；野生型引物为野生型上游引物或野生型下游引物；突变型引物为突变型上游引物或突变型下游引物；通用引物为通用上游引物或通用下游引物；所述的基因突变检测体系为双管PCR体系，其中一管包括野生型引物、突变型blocker引物和通用引物，另一管包括突变型引物、野生型blocker引物和通用引物。2.根据权利要求1所述的高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，所述野生型引物和野生型模板互补，所述突变型引物和突变型模板互补；所述野生型引物和突变型引物的3’端的末端碱基或在引物序列中间的一个碱基不同，其它序列相同；所述野生型引物和突变型引物的长度为15-35个碱基。3.根据权利要求2所述的高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，所述通用引物分别和所述野生型模板、突变型模板均互补，其长度为15-35个碱基。4.根据权利要求3所述的高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，所述野生型blocker引物和野生型模板互补，所述突变型blocker引物和突变型模板互补；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的5’端的末端碱基不同或由5’端到引物序列中间所组成的序列片段的一个碱基不同，而其它序列相同；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的长度为15-40个碱基；所述野生型blocker引物和突变型blocker引物不可以发生扩增，所述野生型blocker引物和突变型blocker引物的3’端被修饰基团修饰或3’端有若干个和所述野生型模板、突变型模板均不互补的碱基。5.根据权利要求1所述的高灵敏的基因突变检测体系，其特征在于，所述的通用上游引物选自5’-ACCAGTTGGGCATGTTGA-3’SEQIDNO：1；5’-AGCATTGGAATCCAGAAACCAG-3’SEQIDNO：2；5’-GAATCCAGAAACCAGTTGGGC-3’SEQIDNO：3；5’-TCTCCCTCCCTCCAGGAAGC-3’SEQIDNO：4；5’-GACCGTCGCTTGGTGCA-3’SEQIDNO：5；5’-TACTTGGAGGACCGTCGCT-3’SEQIDNO：6；5’-AGGGCATGAACTACTTGG-3’SEQIDNO：7；野生型下游引物选自：5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’SEQIDNO：8；5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’SEQIDNO：9；5’-GCACCCAGCAGTTTGGCCG-3’SEQIDNO：10；5’-CGAAGGGCATGAGCTGCG-3’SEQIDNO：11；突变型blocker引物选自：5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATC-3’SEQIDNO：12；5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTAC-3’SEQIDNO：13；5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’SEQIDNO：14；5’-ATGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAG-3’SEQIDNO：15；每一个突变型blocker引物的3’端采用磷酸化修饰；突变型下游引物选自：5’-CCAAGTCCTCTCTCTGCAATG-3’SEQIDNO：16；5’-CAAGTCCTCTCTCTGCAATC-3’SEQIDNO：17；5’-GCACCCAGCAGTTTGGCCG-3’SEQIDNO：18；5’-CGAAGGGCATGAGCTGCA-3’SEQIDNO：19；野生型blocker引物选自：5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’SEQIDNO：20；5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATC-3’SEQIDNO：21；5’-CACGCGGATAGCTTCTCCAATGTTACATCCTG-3’SEQIDNO：22；5’-AGCCCAAAATCTGTGATCTTGACATGCTGCG-3’SEQIDNO：23；5’-AGCCCAAAATCTGTGATCTTGACATGCT-3’SEQIDNO：24；5’-GTGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAG-3’SEQIDNO：25；每一个野生型blocker引物3’端采用磷酸化修饰；通用型探针选自：5’-CTGAAAAGTACCTCCATTCGGGT-3’SEQIDNO：26；5’-TTGCTGAAAAGTACCTCCATTCGG-3’SEQIDNO：27；5’-TTTCACCAGTACGTTCCTGGCTGC-3’SEQIDNO：28；5’-CACCAGTACGTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兆成，赵国栋，
申请(专利权)人：苏州唯善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32