一种提高数字PCR灵敏度的检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种提高数字PCR灵敏度的检测方法。将含有DNA模板的溶液变性后，快速分散为数字PCR检测微单元；所述变性为高温变性、DNA解旋酶处理或核酸变性溶液处理中的任意一种，所述的核酸变性溶液为碱性核酸变性溶液。本发明专利技术所述方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。度和较好的重复性。度和较好的重复性。

【技术实现步骤摘要】
一种提高数字PCR灵敏度的检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种提高数字PCR灵敏度的检测方法。

技术介绍

[0002]dPCR(digital PCR或dPCR)技术是一种新兴的用于核酸检测和定量的分子生物学方法，是继实时荧光定量PCR(real
‑
time quantitative PCR,qPCR)技术之后发展起来的又一种传统PCR技术的改良与升级。与qPCR相比，dPCR不依赖于标准曲线或内参照就可以对靶序列进行绝对定量，直接得出反应体系中靶序列的拷贝数。因此，dPCR比qPCR具有更高的灵敏度和准确度。特别是在痕量核酸检测、复杂背景下稀有突变检测、表达水平的微小差异检测以及拷贝数变异检测等方面，dPCR比qPCR具有明显的优势和广阔的应用前景。
[0003]dPCR的原理是将一个qPCR反应随机分配到大量微小的反应单元中，使得部分反应微单元包含而其余反应微单元不包含模板分子后，再将整个反应体系进行PCR扩增。扩增反应结束后，对全部反应微单元中发生PCR扩增的阳性微单元进行计数，再根据泊松分布的统计学原理和阳性微单元所占比例计算出整个反应体系中靶序列的拷贝数。实际上dPCR是一种终点PCR技术，其结果判读只判断有/无两种扩增状态，因此与qPCR不同，dPCR不依赖Ct值的检测，故而其结果受PCR扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力则大大提高。此外，由于dPCR将整个反应体系分配到大量反应微单元中，每个反应微单元中与靶序列具有竞争作用的背景序列的相对浓度大大降低，使得靶序列的扩增反应更容易进行，这也是dPCR特别适合在复杂背景中检测稀有突变的原因。
[0004]然而是在实际应用过程中，对于一些低拷贝模板，尤其是对于稀有突变检测时，由于靶标浓度过低，会导致其检测灵敏度显著降低，且重复性较差。本专利技术提供了一种进一步提高数字PCR检测灵敏度的方法，对于双链DNA灵敏度提升效果显著。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是开发一种提高数字PCR检测灵敏度的方法，解决当前在低拷贝稀有突变检测中灵敏度和重复性不足的问题。
[0006]本专利技术提供的技术方案如下：
[0007]一种提高数字PCR灵敏度的检测方法，将含有DNA模板的溶液变性后，快速分散为数字PCR检测微单元；所述变性为高温变性、DNA解旋酶处理或核酸变性溶液处理中的任意一种，所述的核酸变性溶液为碱性核酸变性溶液。
[0008]进一步的，所述的DNA模板为双链DNA模板。
[0009]进一步的，所述的含有DNA模板的溶液为仅包含DNA的水溶液或将DNA与数字PCR反应液混合后的溶液。
[0010]进一步的，所述高温变性还包括加入T字型blockers序列同时进行变性的步骤；所述blockers序列为至少一对；所述blockers序列与数字PCR引物探针序列不能完全重叠。
[0011]进一步的，所述blockers序列为一对部分互补的序列组成，该对blockers序列其
余部分与模板DNA互补，与模板互补的单臂长度不超过10bp。
[0012]进一步的，所述blockers序列为2对，分别为blockers
‑
1和blockers
‑
2；所述的blockers
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1两臂序列为ACACAAAATCACG和CGTGATACAATATT，所述的blockers
‑
2两臂序列为CTTCGGCGATGT和ACATCGTGCCTC。
[0013]进一步的，PCR程序中的正向引物序列为CTGGACTATGTCCGGGAAC，反向引物序列为CTTTGCGATCTGCAC ACAC，探针序列为TTGGCTCCCAGTACCTGCTCA。。
[0014]进一步的，高温变性温度为80
‑
100℃；变性时间为5min。
[0015]进一步的，在高温变性后将溶液快速冷却至10
±
10℃后再进行分液。
[0016]进一步的，所述DNA解旋酶为UvrD解旋酶，浓度为200ng/μL，处理方式为将DNA中加入0.5μL的UvrD解旋酶，37℃孵育30分钟。
[0017]有益效果
[0018]本专利技术提供一种提高数字PCR检测灵敏度的方法，该方法操作简便，且成本低廉，对于双链DNA的灵敏度提升效果显著，且不受DNA浓度和扩增子大小的限制，对于数字PCR在液体活检领域，尤其是对于cfDNA中稀有突变的检测具有重要的意义，该方法还具有重复性好，应用范围广的优势。
附图说明
[0019]图1为该专利技术原理示意图(A为本专利技术的流程图；B为直接分液与变性后分液的对比结果)；
[0020]图2为该专利技术中blockers序列与模板反应示意图；
[0021]图3为本专利技术方法采用高温变性增强数字PCR检测灵敏度的效果对比图，对照组为未进行高温变性，实验组为采用高温变性后
[0022]图4为本专利技术方法采用核酸变性溶液处理后增强数字PCR检测灵敏度效果对比图，对照组为未进行处理，实验组为采用核酸变性溶液处理后效果；
[0023]图5为本专利技术实施例3中针对EGFR基因设计了2对blockers序列与EGFR基因序列理论结合示意图；
[0024]图6位本专利技术方法在加入blockers序列前后效果对比图，对照组为未进行任何变性处理，无blockers为加热变性后再降温孵育后结果，1对blockers和2对blockers是分别加入1对blockers和2对blockers之后加热变性后再降温孵育后的结果。
具体实施方式
[0025]一种提高数字PCR灵敏度的检测方法，该方法涉及核酸变性及分液步骤，所述的核酸变性方法包括高温变性、DNA解旋酶处理或核酸变性溶液处理等，所述的分液步骤为采用微滴法或芯片法将上述已经变性好的溶液分散为不少于20000个反应的微单元。
[0026]包括以下步骤：在数字PCR分液前，将含有DNA模板的溶液变性后，采用微流控方式分散为油包水的微液滴式数字PCR检测微单元或采用含有数万个微孔的芯片，将溶液分散至各微孔中形成数字PCR检测微单元；所述的DNA模板为双链DNA模板；所述的含有DNA模板的溶液，可以是仅包含DNA的水溶液，或将DNA与数字PCR反应液混合后的溶液；所述数字PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg
2+
、dNTPs、数字PCRbuffer和去离子水；高温变性温度区间在80
‑
100℃；在高温变性后需立刻转移至冰浴中或使用金属浴采用2
‑
4℃/秒的速度冷却至10
±
10℃后再进行分液；变性步骤可加入与引物探针浓度接近的人工设计的外源T字型blockers序列同时进行变性；T字型blockers序列设计时应在目标扩增子范围之内，或不超过其上下游50bp以内的范围，所述的blocker本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高数字PCR灵敏度的检测方法，其特征在于，将含有DNA模板的溶液变性后，快速分散为数字PCR检测微单元；所述变性为高温变性、DNA解旋酶处理或核酸变性溶液处理中的任意一种，所述的核酸变性溶液为碱性核酸变性溶液。2.根据权利要求1所述的提高数字PCR灵敏度的检测方法，其特征在于，所述的DNA模板为双链DNA模板。3.根据权利要求1所述的提高数字PCR灵敏度的检测方法，其特征在于，所述的含有DNA模板的溶液为仅包含DNA的水溶液或将DNA与数字PCR反应液混合后的溶液。4.根据权利要求1所述的提高数字PCR灵敏度的检测方法，其特征在于，所述高温变性还包括加入T字型blockers序列同时进行变性的步骤；所述blockers序列为至少一对；所述blockers序列与数字PCR引物探针序列不能完全重叠。5.根据权利要求1所述的提高数字PCR灵敏度的检测方法，其特征在于，所述blockers序列为一对部分互补的序列组成，该对blockers序列其余部分与模板DNA互补，与模板互补的单臂长度不超过10bp。6.根据权利要求1所述的提高数字PCR灵敏度的检测方法，其特征在于，所述blockers序列为2对，分别为blockers
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘兆成，赵国栋，熊尚岷，
申请(专利权)人：苏州唯善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：