一种基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒及其检测方法，检测试剂盒至少包括基因定量参考物，底漆/探针混合物，qPCR反应缓冲液和DNA稀释液；检测方法步骤包括以下几步：(1)标准曲线的确定；(2)基因定量参考物的稀释；(3)qPCR反应液的制备和加样；(4)qPCR测试与程序的参数设置；(5)qPCR结果分析。本发明专利技术提供的一种基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒及其检测方法，试剂盒及其检测方法通过采用线性的DNA使其PCR的扩增效率保持在了90～110％，在满足了商品化需求的前提下，扩展了试剂盒的应用范围和领域，以及进行检测的准确度，适宜在医学检测领域推广。在医学检测领域推广。

【技术实现步骤摘要】
一种基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及专利IPC分类的G01N33/68领域，尤其涉及一种基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]细胞与基因治疗过程中，CAR基因拷贝数的检测是评估细胞产品的质量与临床疗效的重要手段。本试剂盒基于荧光探针法，采用多重PCR法检测转移质粒上与整合或表达功能相关的DNA序列和人体细胞中内参基因(Reference Gene，RFG)，计算得到样本中CAR基因拷贝数/细胞。
[0003]该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
[0004]但是，现有技术使用的多重PCR
‑
荧光探针法，但由于qPCR反应扩增效率较低(<90％)，难以满足商品化的要求(至少大于90％)，限制了该检测方法及其试剂盒的应用范围和领域，以及进行检测的准确度。
[0005]因此，为了解决上述问题本申请提供了一种关于CAR基因拷贝数的试剂盒及其检测方法。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术第一方面提供了一种基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒，所述检测试剂盒至少包括基因定量参考物，底漆/探针混合物，qPCR反应缓冲液和DNA稀释液。
[0007]作为一种优选的方案，所述底漆/探针混合物包括5`6
‑
FAM，3`BHQ1双标记修饰探针。
[0008]作为一种优选的方案，所述底漆/探针混合物包括5`CY5，3`BHQ2双标记修饰探针。
[0009]作为一种优选的方案，所述qPCR反应缓冲液至少包括SuperFast Probe Mixture和无酶水。
[0010]作为一种优选的方案，所述SuperFast Probe Mixture和无酶水的体积比为20～30：3～6。
[0011]作为一种优选的方案，所述检测试剂盒的检测适用机型为ABI PRISM 7500，CFX96和Linegene 9600plus。
[0012]本专利技术第二方面提供了一种上述基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒的检测方法，步骤包括以下几步：(1)标准曲线的确定；(2)基因定量参考物的稀释；(3)qPCR反应液的制备和加样；(4)qPCR测试与程序的参数设置；(5)qPCR结果分析。
[0013]作为一种优选的方案，所述标准曲线的确定的具体操作为：(1)将基因定量参考物
浓度标注于管壁标签，确认后进行稀释；(2)将稀释结果通过换算公式进行计算基因拷贝数；(3)得到CAR和RFG基因拷贝数后确认标准曲线；
[0014]所述换算公式为：质粒拷贝数＝6.02
×
10
14
×
质粒浓度ng/μL/质粒碱基数
×
660。
[0015]作为一种优选的方案，所述基因定量参考物的稀释的具体操作为：(1)取出基因定量参考物，DNA稀释液置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，瞬时离心；(2)取7支干净的1.5mL离心管，分别标记为STD0，STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6；(3)在STD0管中用DNA稀释液将CAR定量参考品稀释10倍，得到STD0，振荡混匀后短时间快速离心10s；(4)在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，ST6D管中分别加入90μLDNA稀释液；(5)依次通过使用STD0，STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，ST6D进行梯度稀释，得STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，ST6D稀释液。
[0016]作为一种优选的方案，所述梯度稀释的结果如下表所示：
[0017][0018]作为一种优选的方案，所述qPCR反应液的制备和加样的具体操作为：(1)根据确认的标准曲线以及样本数量进行反应孔数计算与设置；(2)根据反应孔数计算所需qPCR反应液的总量；(3)取出各试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，进行qPCR反应液的配制。
[0019]作为一种优选的方案，所述反应孔数的计算公式为：反应孔数＝(6个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+待测样本数)
×3[0020]作为一种优选的方案，所述qPCR反应液的总量计算公式为：qPCR反应液的总量＝(反应孔数+2)
×
20μL。
[0021]作为一种优选的方案，所述qPCR反应液的配制如下表所示：
[0022]组分单孔反应
qPCR反应缓冲液10～13μL底漆/探针混合物2～5μL总体积12～18μL
[0023]作为一种优选的方案，所述反应孔的加样如下表所示：
[0024][0025]作为一种优选的方案，所述反应快加样完成后每孔总体积为20μL，之后将96孔板轻微振荡混匀，短时间快速离心10s后放入qPCR仪。
[0026]作为一种优选的方案，所述qPCR仪为CFX96 qPCR仪，购买自BIO
‑
RAD公司。
[0027]作为一种优选的方案，所述qPCR测试与程序的参数设置的具体操作为：(1)创建实验反应程序，设置两步法反应程序：PCR反应程序如下：95℃预变性10min；95℃15s，60℃60s，40个循环，反应体积20μL；(2)创建实验反应板，点击Select Fluorophores选择荧光FAM和Cy5；在反应板图表中，选择样品孔，在Sample Type中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，Target Name命名为CAR；勾选荧光Cy5，Target Name命名为RFG，输入每个样品的重复次数及Sample Name；在反应板图表中，选择标曲孔，在Sample Type中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，Target Name命名为CAR；勾选荧光Cy5，Target Name命名为RFG，输入每个稀释梯度的重复次数及Sample Name。并且分别在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6的Concentration一栏赋值为3E+06、3E+05、3E+04、3E+03、3E+02、3E+01，单位为copies/μL；点击Start Run，选择保存路径。
[0028]作为一种优选的方案，所述qPCR结果分析具体操作为：(1)点击资料分析视窗Quantitation，可读取标准曲线的斜率(Slope)、截距(Intercept)、扩增效率(Effect)、R2；(2)在视窗Quantitation Data中，SQ Mean一栏可读取无模板对照NTC、待测样本的CAR和RFG检测值，单位为copies/μL；(3)无模板对照NTC检测结果应为N/A或Ct值大于标准曲线最低浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒至少包括基因定量参考物，底漆/探针混合物，qPCR反应缓冲液和DNA稀释液。2.根据权利要求1所述的基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于：所述qPCR反应缓冲液至少包括SuperFast Probe Mixture和无酶水。3.根据权利要求2所述的基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于：所述SuperFast Probe Mixture和无酶水的体积比为20～30：3～6。4.一种根据权利要求3所述的基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤包括以下几步：(1)标准曲线的确定；(2)基因定量参考物的稀释；(3)qPCR反应液的制备和加样；(4)qPCR测试与程序的参数设置；(5)qPCR结果分析。5.根据权利要求4所述的基因组中CAR基因拷贝数检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述标准曲线的确定的具体操作为：(1)将基因定量参考物浓度标注于管壁标签，确认后进行稀释；(2)将稀释结果通过换算公式进行计算基因拷贝数；(3)得到CAR和RFG基因拷贝数后确认标准曲线；所述换算公式为：质粒拷贝数＝6.02
×
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质粒浓度ng/μL/质粒碱基数
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660。6.根据权利要求5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽美，李查，张天扬，张煜晗，郑孟韬，蔡宇卿，
申请(专利权)人：江苏谱新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：