DNA单分子有序化测序方法技术

一种ＤＮＡ单分子有序化测序的方法，该方法包括下列步骤：（１）将ＤＮＡ样品溶液滴加在基底表面，利用“分子梳”技术将ＤＮＡ单分子拉直并固定；（２）利用原子力显微镜（ＡＦＭ）对样品分子进行成像；（３）利用ＡＦＭ的“逐线反馈纳米操纵技术”将ＤＮＡ分子依次切隔成小片段；（４）利用“单个生物大分子的分离方法”依次对ＤＮＡ小片段进行拾取；（５）利用ＰＣＲ技术分别对所分离到的ＤＮＡ分子进行扩增；（６）对扩增后的ＤＮＡ样品进行测序。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA测序方法，特别是一种基于原子力显微镜纳米操纵的在单个DNA分子水平上进行有序化测序的方法。
技术介绍
目前DNA测序方法大都以Sanger(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.745463-55467)与Maxam和Gilbert(Maxam&Gilbert(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74560-564)的方法为基础，在试剂和方法等方面加以改进和完善。多路测序(multiplexsequencing)、毛细管凝胶电泳和自动凝胶电泳技术的引进，使基于Sanger方法的测序效率大大提高。但这些方法都只能测定短的DNA片段，因此DNA首先内切酶或超声波随机打断成小片段，然后对每个片段的碱基序列进行分析。很显然，DNA小片段在其原始位置信息的丧失导致了DNA序列测定是十分困难的。也有一些与Sanger方法完全不同的新方法，如扫描探针显微术(Minne etal.(1998)Appl.Phys.Lett.722340-2342)、纳米孔(Vercoutere at al.(2001)Nature Biotechnol19248；Deamer&Akeson.(2000)TIBTECH APRIL 18147-151)、时间飞行质谱(Wu et al.(1994)Anal.Chem.661637-45)、焦磷酸检测分析(Ronaghi et al.(1996)Anal.Biochem.24284-89；Ronaghi et al.(1996)Science 281363-365)、外切酶测序(Sauer et al.(1999)Phys.Chem.Chem.Phys.12472-77)、杂交测序(Service(1998)Science 282396-399&399-401)等。这些方法能较快速的对较少量的DNA样品进行测序，但在核苷酸的读出长度、分辨相邻核苷酸的鉴别能力以及操作的实用性上存在局限性。(Marziali&Akeson(2001)Annu.Rev.Biomed.Eng 3195-223；Meldrum(2001)Science 292515-517)。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是克服上述已有方法的困难和局限，提供一种可对单个分子数量的样品进行较为简单快速地获得DNA序列的方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术的技术解决方案是一种DNA单分子有序化测序方法就是对DNA单分子按次序进行测序，本方法是通过分子梳技术将DNA分子拉直并固定在基底上，再利用原子力显微镜依次进行切割和分离DNA片段，然后进行PCR扩增和测序。该方法包括下列步骤(1)将DNA样品溶液滴加在基底表面，利用分子梳技术将DNA单分子拉直并固定；(2)利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像；(3)利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”将DNA分子依次切隔成小片段；(4)利用“单个生物大分子的分离方法”依次对DNA小片段进行分离；(5)利用PCR技术分别对所分离的DNA分子进行扩增；(6)对放大后的DNA样品进行测序。所说的基底可以是云母，也可以是硅，也可以是化学修饰后云母。所说的化学修饰后的云母，即新剥离的云母表面用0.5～1％的APTES水溶液处理2分钟，用双蒸水洗涤后，在80℃～200℃环境下烘烤1～4小时，然后放在干燥器中备用。所说的DNA单分子可以为质粒DNA、基因组DNA、BAC、YAC、cDNA、染色体以及克隆了的或经PCR技术扩增得到的DNA片段，可以是各种方法制备的DNA片段包括机械打断的片段、直接提纯的片段。所说的原子力显微镜探针可在空气、液体或真空环境中进行操作。所说原子力显微镜的探针的针尖可以是针尖阵列，可以进行并行分离、拾取和测序。附图说明图1是DNA单分子有序化测序的流程示意图。图2是利用AFM的“逐线反馈纳米操纵技术”将拉直固定在云母表面的DNA分子依次切隔形成小片段的AFM探测所获得的图像。图3是利用“单个生物大分子分离方法”对切割制备的DNA分子片段进行分离前后的AFM探测结果。具体实施例方式下面着重以λDNA分子为例来说明本专利技术的方法本专利技术对DNA分子进行有序化测序方法，包括下列步骤 1、将DNA样品溶液滴加在基底表面，利用“分子梳”技术将DNA单分子拉直并固定。为了使DNA分子在基底表面的有适中的吸附力以同时满足AFM成像和可以分离的需要，我们采用了用0.5～1％的APTES水溶液处理基底2分钟，然后在80℃～200℃环境下烘烤的过程，最后用“分子梳”技术将DNA拉直固定在基底上(关于基底处理以适合于DNA拉直的要求，请参见我们的专利胡钧，黄一波，张益，欧阳振乾，李民乾。一种用于DNA操纵的云母衬底的制造方法。专利技术专利，申请号00116715.4，申请日20000623)。2、利用原子力显微镜(AFM)对样品分子进行成像。3、利用AFM的“逐线反馈纳米操纵”技术将DNA分子依次切隔成小片段。“逐线反馈纳米操纵”技术的具体过程为先用AFM轻敲模式(tapping)扫描一条线，获得这条线的信息(力，或者它所转换成的高度)，然后对同一条线进行第二次接触模式(contact)扫描时进行监视和调整(改变扫描力的大小)从而实现对这条线的操纵。整个成像和操纵过程不用退出AFM的反馈系统而连续进行。在实行“切割”的纳米操纵时，先获得一幅图像，选定感兴趣的区域；接下来，通过增加力来驱动AFM针尖与选定区域接触，从而利用AFM针尖的移动(来回移动的次数与所用力的大小有关)将DNA切断。这样的操纵可以获得很高的精确性，切割DNA时的空间精确度达到＜5nm，而这主要是受针尖尺度的限制。4、利用“单个生物大分子的分离方法”依次对DNA小片段进行分离。利用“单个生物大分子的分离方法”依次对DNA小片段进行分离的操作类似于“逐线反馈纳米操纵”技术中的“切割”过程，不同的是所用的力要小于切割时的域值，通常要小10nN(随针尖的不同而变化)，并且扫描的区域要尽量小(比要分离的目标物体稍大即可)，然后执行二维扫描过程，在此扫描过程中通过改变探针针尖对样品分子所施力的大小，克服基底对样品的吸附使样品转移吸附到针尖上，从而完成DNA小片段的分离。5、利用PCR技术分别对所分离的DNA分子进行放大。6、对放大后的DNA样品进行测序。下面再具体详细地说明DNA单分子有序化测序的方法。1、基底的选择与处理采用了硅烷化的云母作为基底。新剥离的云母表面用0.5-1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane，APTES)水溶液处理，时间为2分钟。处理过的APTES-云母表面用双蒸水洗涤后，在80℃～200℃环境下烘烤1～4小时(优选120℃干燥2小时)，然后放在干燥器中备用。2、DNA样品准备和拉直操纵λDNA购自Sigma公司(美国)；DNA用TE缓冲液(40mM tris-Hcl，1mM EDTA)稀释至1～5ng/μl，取4μl上述DNA溶液滴加于洁净的盖玻片一端，接下来用“分子疏”将DNA拉直。具体做法是，首先将该盖玻片反转，先使带有溶液的一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ单分子有序化测序的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：　　　　（１）将ＤＮＡ样品溶液滴加在基底表面，利用“分子梳”技术将ＤＮＡ单分子拉直并固定；　　　　（２）利用原子力显微镜（ＡＦＭ）对样品分子进行成像；　　　　（３）利用ＡＦＭ的“逐线反馈纳米操纵技术”将ＤＮＡ分子依次切隔成小片段；　　　　（４）利用“单个生物大分子的分离方法”依次对ＤＮＡ小片段进行分离；　　　　（５）利用ＰＣＲ技术分别对所分离到的ＤＮＡ分子进行扩增；　　　　（６）对扩增后的ＤＮＡ样品进行测序。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡钧，李民乾，吕军鸿，
申请(专利权)人：中国科学院上海原子核研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]