一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法技术

本发明专利技术提供了一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS‑荧光RPA检测方法，包括以下步骤：步骤一、引物与探针设计；步骤二、免疫磁珠的制备；步骤三、免疫磁珠分离；步骤四、模板提取；步骤五、三重荧光RPA；步骤六、结果判定。本发明专利技术通过设计特异性的引物与探针，建立3种人畜共患病病原菌多重IMS‑荧光RPA检测体系，采用三重荧光方法，特异性很好，3种荧光信号的收集不会相互干扰，可同时检测三种人畜共患病病原菌；本方法简便快速，特异性好，敏感度高，抗干扰性强，适用范围广，检测成本低，适合基层推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法
本专利技术涉及一种同时检测多种病原菌的方法，具体涉及一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法。
技术介绍
畜牧业的迅猛发展，电商、各类网淘平台的崛起，给人民带来实惠的同时，互通有无的物流业增加了多种病原菌混合感染的风险。沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、布氏杆菌属于人畜共患病的病原菌，其中布氏杆菌属二类动物病原微生物，沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7属三类动物病原微生物。沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌均为具有高致病性的人畜共患致病菌，且普遍存在于环境中，如在食品、水、空气、纺织品和土壤中这三种菌均能长期生存、繁殖，并可在人群中广泛传播，造成严重疫情。目前我国对这三种病原菌的检测仍采用经典的传统分离培养、生化鉴定、血清学方法，为解决传统方法的检测周期长，步骤繁琐、大批量检测工作量大及成本高等问题，快速分子方法如荧光定量PCR、LAMP、RPA技术不断得到发展与完善，近年，多重分子技术的研究已成为行业专家关注的热点。免疫磁珠分离(Immunomagneticseparation，IMS)技术是一种具有高效、特异的样品预处理方法，其原理是利用磁珠表面的活性基团与目标菌抗体进行偶联，制成特异性免疫磁珠，然后在液相中与目标菌发生抗原抗体结合，经外磁场作用，将带目标菌的磁珠从复杂的样品基质中特异分离。该技术利用抗原抗体之间的特异结合，高效富集目标菌，并保留目标菌原有生物活性，利于下游的检测鉴别，是一种理想的样品预处理方法，被广泛应用于致病菌检测的样品预处理。重组酶聚合酶等温扩增(Recombinaseploymeraseamplification，RPA)技术被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDxInc开发)，首先，体系中重组酶和引物37℃条件下形成酶和引物的聚合体并在模板DNA上寻找完全互补的序列；定位后启动DNA合成；在扩增体系中加入一个荧光标记的探针，通过收集荧光即可实现检测过程实时监测。目前，国内外还没有采用IMS技术结合RPA技术同时针对沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、布氏杆菌3种人畜共患病鉴定的有关研究报道。本专利技术结合IMS、RPA两种技术优势，同时用3种特异性免疫磁珠分离基质中沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌，磁珠分离液可直接提取DNA，同时用3种特异性引物及探针，实现对沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌的同时检测，达到微生物致病菌的快速、高效、高通量检测的目的。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法，达到快速、高效、高通量检测的效果。具体技术方案如下：一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法，包括以下步骤：步骤一、引物与探针设计：选择沙门氏菌fimY位点、大肠杆菌O157：H7Mannosyltransferase位点、布氏杆菌Omp31位点为靶基设计引物和探针，表1所示；表1多重荧光RPA扩增用特异引物及探针序列步骤二、免疫磁珠的制备：取0.1mL磁珠液于盛有1.0mLPBST缓冲液的离心管中，混匀，3000r/min离心2min，弃液体；重复上述步骤清洗3次，加入1.0mLPBST缓冲液使磁珠重悬其中；向上述重悬液中加入0.1mL沙门氏菌属免疫血清，放摇床，室温轻缓旋转振荡3h；用1.0mL1×洗液清洗5次后，加入0.5mL重悬液，于4℃保存备用；重复以上操作制备大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌免疫磁珠液；步骤三、免疫磁珠分离：无菌操作取20g检样至装有200mL蛋白胨水的带滤网无菌均质袋内，轻缓振荡30min；过滤检样上清液转移于离心管，5000r/min离心20min，弃上清液体，沉淀重悬于1.0mLPBST缓冲液中；取全部检样悬液于装有0.1mL免疫磁珠悬液的小管中，室温轻缓旋转振荡30min；小心移出管中液体，加入1.0mL洗液混匀，3min后移出洗液，重复清洗5次，加入0.5mL重悬液使吸附目标菌的磁珠重悬其中；带有目标菌的磁珠重悬液可直接用于细菌基因组DNA提取；步骤四、模板提取：取步骤二所得全部带有目标菌的磁珠重悬液10000r/min离心1min，弃上清；按细菌基因组DNA提取试剂盒提供的操作手册提取DNA；得到的核酸用NanoDrop1000分光光度计测定其浓度和纯度；步骤五、三重荧光RPA：三重荧光RPA的反应体系为50μL，包括RehydrationBuffer29.5μL，ddH2O3.3μL，PrimerF(10μM)、PrimerR(10μM)各1.5μL，TwistAmpnexonProbe(10μM)0.5μL，基因组DNA各1μL，最后加入MgAc(280mM)2.5μL；向含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmpExoRPA反应管中依次加入上述反应体系各成分，充分混匀后2000r/min离心10sec，将反应试管放在RPA荧光定量PCR仪7500Fast中进行实时荧光扩增，37℃恒温反应40min；步骤六、结果判定：RPA反应设置三个荧光通道(FAM、HEX、cy5)，反应过程实时收集荧光，反应结束后能收集到荧光信号，并有明显扩增曲线，方可判定为阳性。本专利技术中用到的设备和材料如下：1实验菌株及样品所用菌株共32株，具体信息如表2。表2本实验所用菌株信息实验所用皮张、毛皮、纺织品样品1-60号购自郑州各大购物市场，其余60份属课题组收集样品，主要来自酒店、衣服出租店、医院、火车卧铺、皮张加工厂等公共场所。2主要试剂蛋白胨水(购自陆桥公司)；沙门氏菌属、大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌免疫血清(デソカ生研株式会社产品)；磁珠液DynabeadsM-280Sheepanti_RabbitIgG(Dynal公司产品)；PBST缓冲液(Dynal公司产品)；10×洗液(Dynal公司产品)；重悬液(Dynal公司产品)；细菌基因组DNA提取试剂盒(购自陆桥公司)；RPA荧光检测试剂盒(TwistAmpDNAAmplificationExoKits)(英国TwistDX公司产品)。3主要仪器磁力架，英国MatrixPathatrix公司；离心机，德国Eppendorf公司；微量分光光度计NanoDrop，美国赛默飞公司；荧光定量PCR仪7500Fast，美国ABI(AppliedBiosystem)公司；4引物与探针将设计好的设计引物和探针序列发南京金斯瑞生物科技有限公司合成。本专利技术通过沙门氏菌fimY基因、大肠杆菌O157：H7Mannosyltransferase基因、布氏杆菌Omp31基因的分析，设计特异性的引物与探针，建立3种病原菌多重IMS-荧光RPA检测体系。本方法采用了三重荧光方法，目前已有报道建立了针对细菌RPA检测方法，未见有针对人畜共患病病原菌的三重荧光RPA方法，三重荧光引物、探针设计复杂，反应条件不易优化，方法建立人员必须有较高的分子生物学理论基础，较强的实验能力。结果表明，多重荧光定量RPA特异性很好，且不同浓度的DNA检测中3种基因扩增效率基本相同，3种荧光信号的收集不会相互干扰，且检测限可达3.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS‑荧光RPA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、引物与探针设计：选择沙门氏菌fimY位点、大肠杆菌O157：H7 Mannosyltransferase位点、布氏杆菌Omp31位点为靶基设计引物和探针；步骤二、免疫磁珠的制备：取0.1mL磁珠液于盛有1.0mL PBST缓冲液的离心管中，混匀，3000r/min离心2min，弃液体；重复上述步骤清洗3次，加入1.0mL PBST缓冲液使磁珠重悬其中；向上述重悬液中加入0.1mL沙门氏菌属免疫血清，放摇床，室温轻缓旋转振荡3h；用1.0mL 1×洗液清洗5次后，加入0.5mL重悬液，于4℃保存备用；重复以上操作制备大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌免疫磁珠液；步骤三、免疫磁珠分离：无菌操作取20g检样至装有200mL蛋白胨水的带滤网无菌均质袋内，轻缓振荡30min；过滤检样上清液转移于离心管，5000r/min离心20min，弃上清液体，沉淀重悬于1.0mL PBST缓冲液中；取全部检样悬液于装有0.1mL免疫磁珠悬液的小管中，室温轻缓旋转振荡30min；小心移出管中液体，加入1.0mL洗液混匀，3min后移出洗液，重复清洗5次，加入0.5mL重悬液使吸附目标菌的磁珠重悬其中；带有目标菌的磁珠重悬液可直接用于细菌基因组DNA提取；步骤四、模板提取：取步骤二所得全部带有目标菌的磁珠重悬液10000r/min离心1min，弃上清；按细菌基因组DNA提取试剂盒提供的操作手册提取DNA；得到的核酸用NanoDrop 1000分光光度计测定其浓度和纯度；步骤五、三重荧光RPA：三重荧光RPA的反应体系为50μL，包括Rehydration Buffer 29.5μL，ddH2O 3.3μL，Primer F(10μM)、Primer R(10μM)各1.5μL，Twist Ampn exon Probe(10μM)0.5μL，基因组DNA各1μL，最后加入MgAc(280mM)2.5μL；向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo RPA反应管中依次加入上述反应体系各成分，充分混匀后2000r/min离心10sec，将反应试管放在RPA荧光定量PCR仪7500Fast中进行实时荧光扩增，37℃恒温反应40min；步骤六、结果判定：RPA反应设置三个荧光通道(FAM、HEX、cy5)，反应过程实时收集荧光，反应结束后能收集到荧光信号，并有明显扩增曲线，方可判定为阳性。...

【技术特征摘要】
1.一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、引物与探针设计：选择沙门氏菌fimY位点、大肠杆菌O157：H7Mannosyltransferase位点、布氏杆菌Omp31位点为靶基设计引物和探针；步骤二、免疫磁珠的制备：取0.1mL磁珠液于盛有1.0mLPBST缓冲液的离心管中，混匀，3000r/min离心2min，弃液体；重复上述步骤清洗3次，加入1.0mLPBST缓冲液使磁珠重悬其中；向上述重悬液中加入0.1mL沙门氏菌属免疫血清，放摇床，室温轻缓旋转振荡3h；用1.0mL1×洗液清洗5次后，加入0.5mL重悬液，于4℃保存备用；重复以上操作制备大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌免疫磁珠液；步骤三、免疫磁珠分离：无菌操作取20g检样至装有200mL蛋白胨水的带滤网无菌均质袋内，轻缓振荡30min；过滤检样上清液转移于离心管，5000r/min离心20min，弃上清液体，沉淀重悬于1.0mLPBST缓冲液中；取全部检样悬液于装有0.1mL免疫磁珠悬液的小管中，室温轻缓旋转振荡30min；小心移出管中液体，加入1.0mL洗液混匀，3min后移出洗液，重复清洗5次，加入0.5mL重悬液使吸附目标菌的磁珠重悬其中；带有目标菌的磁珠重悬液可直接用于细菌基因组...

【专利技术属性】
技术研发人员：李轲，禹建鹰，张淑霞，徐超，连素梅，郭会清，
申请(专利权)人：郭会清，
类型：发明
国别省市：河南,41