环介导恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的方法技术

本发明专利技术公开了一种环介导恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测肺炎支原体特异基因P1的方法，本发明专利技术还提供了用于上述扩增的一组引物序列。所述方法在环介导恒温扩增中的内引物FIP的5’端标记荧光素(FITC)，在环引物LF的5’端标记生物素(biotin)，所述方法针对肺炎支原体特异基因P1的扩增产物能被纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，灵敏度范围为60ng～600fg，并能准确地鉴别肺炎支原体，具有优异的特异性。

【技术实现步骤摘要】
环介导恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的方法
本专利技术公开了一种基因扩增方法，属于分子生物学

技术介绍
肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)，属柔膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属，它是介于细菌和病毒之间的能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核生物。MP是社区获得性肺炎的重要病原体之一，约占社区获得性肺炎的10％-40％，在流行高峰年或者在半封闭的空间MP感染率甚至可高达50％-80％，在某些地区MP甚至已经超过肺炎链球菌成为最常见的社区获得性肺炎的病原菌。MP感染在人群中呈现常年散发和周期性流行的特点，一般每3-7年会有区域性的MP流行高峰出现。同时，MP可在人群中暴发流行，易发生在封闭或半封闭的环境中，特别是学校、军营和养老院是暴发流行的好发地点。MP在各年龄均可发病，尤其是儿童和青少年。MP感染后临床症状呈现多样性，轻者可无任何症状，重者除了可引起常见的呼吸系统疾病，如发热、咳嗽、咳痰、全身不适、支气管炎、细支气管炎、肺不张、呼吸窘迫等，还可以引起全身多系统肺外并发症，涉及到血液系统、心血管系统、消化系统、泌尿系统等。MP引起的临床症状很难与其他呼吸道病原菌引起的疾病进行鉴别。因此，研发一个简单、快速、灵敏性和特异性较高的MP的检测方法，对于及时诊断和治疗MP感染患者尤为重要。MP的诊断方法有培养法、血清学检测和分子生物学检测方法。虽然培养法是MP诊断的金标准，但是MP对培养条件要求苛刻，生长缓慢，一般为7-10天，做出判断需要3-4周，无早期诊断价值，并且检出率比较低。血清学检测因它的便利性和快捷性仍是目前国内外最常用的MP感染诊断方法，在MP感染的诊断中起到非常重要的作用，但是血清学抗体检测存在窗口期和抗体持续存在的问题以及不同检测试剂盒之间敏感性和特异性存在较大的差异，因此限制了它的临床使用。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于MP的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断MP的PCR方法和Real-timePCR方法，检测灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。环介导恒温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是由Notomi等专利技术的一种新型核酸特异性扩增技术。该技术灵敏高、操作简单、产物易检测等优点，已被广泛用于分子生物研究和诊断领域。为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。近期，研究人员将LAMP技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖LAMP技术、实现快速，敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为环介导恒温扩增结合纳米生物传感的核酸诊断技术(Loop-mediatedisothermalamplificationlabel-basedNanoparticlesLateralFlowBiosensor,LAMP-LFB)。本专利技术将LAMP-LFB技术用于肺炎支原体的检测，针对肺炎支原体的特异基因P1设计一套LAMP扩增引物，旨在验证、评价LAMP-LFB技术及建立针对肺炎支原体的快速、敏感和特异的LAMP-LFB检测体系。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种环介导恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供如SEQIDNO：1所示的外引物F3，SEQIDNO：2所示的外引物B3，SEQIDNO：3所示的内引物FIP，SEQIDNO：4所示的内引物BIP，SEQIDNO：5所示的环引物LF，SEQIDNO：6所示的环引物LB，其中，选择以上任一引物的5’端标记半抗原，选择任意另一种引物的5’端标记生物素(Biotin)；(3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物以及脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；(4)使用高分子纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。在一个优选的实施方案中，，在5’端标记有半抗原的引物为FIP，在5’端标记有生物素的引物为LF。在一个更为优选的实施方案中，在引物FIP的5’端标记的半抗原为荧光素(FITC)。更为优选地，所述高分子纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在结合垫、检测线、及控制线区域依次包被有色基团修饰的亲和素化的高分子纳米粒子、羊抗FITC抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。在一个优选的实施方案中，所述恒温扩增是在60-67℃的环境中进行的。在一个更为优选的实施方案中，所述恒温扩增是在65℃的环境中进行的。其次，本专利技术还提供了一组用于恒温扩增肺炎支原体特异基因P1的引物序列，所述序列包括：如SEQIDNO：1所示的引物F3，SEQIDNO：2所示的引物B3，SEQIDNO：3所示的引物FIP，SEQIDNO：4所示的引物BIP，SEQIDNO：5所示的引物LF，SEQIDNO：6所示的引物LB，其中，选择以上任一引物的5’端标记半抗原，选择任意另一种引物的5’端标记生物素。在一个优选的实施方案中，在5’端标记有半抗原的修饰引物为FIP，在5’端标记有生物素的修饰引物为LF。在一个更为优选的实施方案中，在引物FIP的5’端标记的半抗原为荧光素(FITC)。所述方法针对肺炎支原体特异基因P1的扩增产物能被纳米生物传感器可视化检测。该方法具有优异的检测灵敏度，其检测范围为60ng～600fg，而且也具有较快的检测速度，仅需60分钟，即可获得能供可视化LFB检测的扩增产物。以常见的致病菌及条件致病菌DNA(肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎链球菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、类志贺单胞菌、沙门氏菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、稀氏肠球菌、粪肠球菌、屎肠球菌)为模板评价MP-LAMP-LFB技术的特异性。MP-LAMP-LFB技术能准确地鉴别肺炎支原体，具有优异的特异性。附图说明图1.LAMP-LFB引物设计的位置和方向示意图；图2.LAMP引物验证及LAMP-LFB检测结果图谱；图3.标准LAMP-LFB最佳反应温度测试结果图谱；图4.LAMP-LFB检测MP的灵敏度结果图谱；图5.LAMP-LFB技术的特异性检测评价图谱。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的保护范围构成任何限制。本专利技术中所涉及的试剂：抗荧光素抗体(anti-FITC)及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)购于Abcam公司。高分子纳米粒子偶联本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环介导恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供如SEQ ID NO：1所示的外引物F3，SEQ ID NO：2所示的外引物B3，SEQ ID NO：3所示的内引物FIP，SEQ ID NO：4所示的内引物BIP，SEQ ID NO：5所示的环引物LF，SEQ ID NO：6所示的环引物LB，其中，选择以上任一引物的5’端标记半抗原，选择任意另一种引物的5’端标记生物素；(3)在链移位型聚合酶Bst 2.0、解链温度调节剂、引物、以及脱氧核糖核苷三磷酸存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；(4)使用高分子纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。

【技术特征摘要】
1.一种环介导恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供如SEQIDNO：1所示的外引物F3，SEQIDNO：2所示的外引物B3，SEQIDNO：3所示的内引物FIP，SEQIDNO：4所示的内引物BIP，SEQIDNO：5所示的环引物LF，SEQIDNO：6所示的环引物LB，其中，选择以上任一引物的5’端标记半抗原，选择任意另一种引物的5’端标记生物素；(3)在链移位型聚合酶Bst2.0、解链温度调节剂、引物、以及脱氧核糖核苷三磷酸存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；(4)使用高分子纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在5’端标记有半抗原的引物为FIP，在5’端标记有生物素的引物为LF。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在引物FIP的5’端标记的半抗原为FITC。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、结合垫...

【专利技术属性】
技术研发人员：申阿东，王亚翠，王毅，焦伟伟，孙琳，李洁琼，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京儿童医院，
类型：发明
国别省市：北京,11