一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法技术

本发明专利技术属于医药制备技术领域，具体涉及一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法，所述冻干保护体系包括核酸扩增试剂和冻干保护剂，核酸扩增试剂为用于LAMP反应扩增试剂，冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种复合物：聚乙二醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、苏氨酸、甘氨酸，且所述冻干保护剂与扩增反应试剂的重量体积比浓度为3％‑25％。本技术中的冻干试剂体积小，冻干时间短、效率高、耗能低，可直接用于基因芯片实验，不会造成试剂反复冻融和浪费，可以有效的保证冻干过程中的有效物质的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法
本专利技术属于医药制备
，具体涉及一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法。
技术介绍
环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，是一种可以在恒温条件下可短时间内实现核酸扩增的技术，具有“简便、快速、低价、精确”的优点，该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上可以媲美PCR反应，可不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。但是LAMP反应的扩增体系中含有聚合酶、dNTP等活性成分，需要在低温条件下保存，使用时需要进行解冻及反复冻融，不仅操作繁琐，且会对试剂中有效成分产生一定的影响甚至是失活。另外，低温保存会增加储存、运输方面的成本以及能耗。冷冻干燥是指将被干燥含水物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。冷冻干燥技术具有如下优点：1)许多热敏性的物质不会发生变性或失活；2)在冻干过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性状；3)体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象；4)干燥在真空下进行，氧气极少，一些易氧化的物质得到了保护；5)能排除95％～99％以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。现有技术存在的缺陷和问题主要包括：1.恒温扩增试剂中含有的酶、dNTP等成分无法在相对高温的条件下稳定存在，需要储存于-20℃的冷冻环境中，且试剂反复复融对于试剂性能有一定的影响，试剂低温保存对于运输、储存及使用过程等有较高的要求，使用本技术可以使恒温扩增试剂于2-8℃或者常温保存；2.使用液体试剂需要长时间解冻以及反复复融，操作比较繁琐；冻干后试剂只需要加入复溶液即可。3.现有专利中的试剂反应体系较大，相同反应所需的冻干试剂体积较大，耗费的时间和能量均较大；而本体系的反应体系较小，对于一张芯片(5-10个反应体系)所需的冻干试剂体系不超过40μL，试剂用量少、冻干时间短、耗能低，冻干成本降低。4.冻干试剂中所用的Bst酶含有一定量的甘油，对试剂形态和冻干过程均会有一定程度的影响，故现有的部分技术需要去除甘油或者购买无甘油的Bst酶，增加了试剂成本；本技术中所用的Bst酶为市售，常见易得、价格相对较低并货源稳定。例如，现有技术“CN105274192A”的中国专利申请公开了一种LAMP反应试剂混合物的保存方法，该方法在试剂混合物中加入了特定的一种或几种冻干保护剂，冻干保护剂与试剂混合物的体积或重量比为5％-20％，冻干后的试剂可于室温长期保存。该方法存在的缺点为：所用的核酸聚合酶为不含甘油的Bst核酸聚合酶。甘油在原料酶溶液中具有保护酶活性的作用，而基本上市面上所售的Bst酶中均含有50％的甘油溶液，少有的不含有甘油的Bst酶可能需定制，且价格高；而购买后进行去甘油处理的Bst酶浓度可能不准确且损失量较大。使用不含甘油的Bst酶会提高试剂成本。还有，现有技术“CN105274192A”的中国专利申请公开了一种环介导等温扩增反应试剂混合物的一种保护方法。该方法通过在环介导等温扩增试剂混合物中添加一种特定的干燥保护剂，然后将混合物在低于80℃的条件下进行真空干燥或快速风干，实现环介导等温扩增反应试剂混合物在常温或室温下的长期保存。该方法存在的缺点为：真空干燥或者快速风干的温度过高，存在试剂失活的风险。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种保证核酸扩增试剂冻干品在2-8℃或者室温下长期保存所需的冻干试剂及保护体系。本专利技术通过以下技术方案来实现：一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系，所述冻干保护体系包括核酸扩增试剂和冻干保护剂，核酸扩增试剂为用于LAMP反应扩增试剂，冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种复合物：聚乙二醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、苏氨酸、甘氨酸，且所述冻干保护剂与扩增反应试剂的重量体积比浓度为3％-25％。通过大量的实验研究发现，所列取冻干保护剂为生物冻干中常用保护剂，对LAMP反应无影响或影响很小。作为本专利技术的一种优选技术方案，LAMP反应扩增试剂的组成为0.1-4.0U/μL的Bst酶、0.0001-0.0005U/μL的UNG酶、0.4-2.0mmol/L的dNTPS(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP)、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO4和纯化水中的两种或两种以上。此配方为试剂为通过大量实验优选得到，是筛选得到的适合LAMP反应扩增的配方。作为本专利技术的一种优选技术方案，冻干保护剂组成按质量比计为：甘露醇3％-12％、聚乙二醇1-5％、苏氨酸0.5％-2％，余量为纯化水。通过大量的实验研究发现，该保护剂配方中可使得冻干试剂形态较好，试剂性能较好且可长期稳定储存。作为本专利技术的一种优选技术方案，反应扩增试剂分为冻干部分试剂以及复溶液，冻干部分试剂如前所述，所述复溶液含有分别为0.4-2.0mmol/L的dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO4中的两种或两种以上。具体的优选的复溶配置和使用方法包括：将MgSO4(1.0-10.0mmol/L)按照一定的比例溶于纯化水中，加入所述其他物质，使得最终复溶液的体积为30μL/管冻干试剂，将配制好的复溶液标明配制时间及保存条件(4℃)待用。取出一管已冻干的试剂，加入30μL复溶液，震荡至冻干试剂完全溶解，离心后可进行扩增反应。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述荧光染料选择SYBRGREENI或EVAGREEN。作为本专利技术的一种优选技术方案，冻干体系包括：核酸扩增试剂的冻干试剂1-10μL，以及冻干保护剂混合液5-30μl，终冻干体系约为6-40μL，冻干用离心管为100μL、200μL、500μL、1500μL中的一种。通过大量的实验研究发现，进一步优选选用500μL的离心管。相对于200μL离心管，选用500μL离心管可以使得试剂形态良好，冻干时间大大缩短；相对于1500μL，500μL离心管单价较低，节约资源。本专利技术的另一目的在于提供一种制备前述的冻干保护体系的方法，包括：1)核酸扩增试剂配制步骤：将Bst酶、UNG酶、dNTPS(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP)、甜菜碱、荧光染料(SYBRGREENI或EVAGREEN)、MgSO4和纯化水中的两种或两种以上取出置于室温中，待试剂融化后，按照一定的体积比例取出，置于同一离心管中，混合均匀，离心备用，标明配制日期和保存条件(-20℃)；2)冻干保护剂配制步骤：(2.1)将各保护剂使用天平称量一定的质量，分别溶于100ml的纯化水中，震荡混匀，配制为保护液原液，标明配制日期和保存条件；(2.2)根据冻干保护剂的配方，按照一定的体积比例取出保护剂，置于同一离心管中，混合均匀，离心备用；3)冻干用液体试剂的配制各取出核酸扩增试剂(100个反应)和冻干保护剂(100个反应)相应的体积混合均匀后进行分装(40μL/反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系，其特征在于，所述冻干保护体系包括核酸扩增试剂和冻干保护剂，核酸扩增试剂为用于LAMP反应扩增试剂，冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种复合物：聚乙二醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、苏氨酸、甘氨酸，且所述冻干保护剂与扩增反应试剂的重量体积比浓度为3％‑25％。

【技术特征摘要】
1.一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系，其特征在于，所述冻干保护体系包括核酸扩增试剂和冻干保护剂，核酸扩增试剂为用于LAMP反应扩增试剂，冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种复合物：聚乙二醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、苏氨酸、甘氨酸，且所述冻干保护剂与扩增反应试剂的重量体积比浓度为3％-25％。2.根据权利要求1所述的冻干保护体系，其特征在于，LAMP反应扩增试剂的组成为0.1-4.0U/μL的Bst酶、0.0001-0.0005U/μL的UNG酶、0.4-2.0mmol/L的dNTPS(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP)、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO4和纯化水中的两种或两种以上。3.根据权利要求1或2所述的冻干保护体系，其特征在于，冻干保护剂组成按质量比计为：甘露醇3％-12％、聚乙二醇1-5％、苏氨酸0.5％-2％，余量为纯化水。4.根据权利要求1或2所述的冻干保护体系，其特征在于，反应扩增试剂分为冻干部分试剂以及复溶液，所述复溶液含有分别为0.4-2.0mmol/L的dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO4中的两种或两种以上。5.根据权利要求2或4所述的冻干保护体系，其特征在于，所述荧光染料选择SYBRGREENI或EVAGREEN。6.根据权利要求1所述的冻干保护体系，其特征在于，冻干体系包括：核酸扩增试剂的冻干试剂1-10μL，以及冻干保护剂混合液5-30μl，终冻干体系约为6-40μL，冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨玲玲，屈彬彬，高亚平，张国豪，吴国君，
申请(专利权)人：百康芯天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12