基于静电亲和纳米转运载体及细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于静电亲和纳米转运载体和细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法。本发明专利技术采用非酶扩增体系，针对检测目标microRNA序列设计特异性带荧光标签的DNA发卡探针H1、H2序列；将H1、H2与纳米金颗粒组装成复合体，转运至肿瘤细胞，当扩增体系中含有待测microRNA，其可与H1结合，导致H1茎部打开，由此产生的部分单链结构与H2相作用，导致H2茎部打开，由此荧光基团FAM与淬灭基团BHQ‑1距离增大，荧光强度增加。用荧光分光光度计检测荧光强度，并用激光扫描共聚焦显微镜记录胞内成像情况。该方法原理简单且检测成本低；具有恒温无酶扩增、灵敏度高、操作简单、易于普及等优点。

Detection of Intracellular MicroRNA by Non-enzymatic Amplification Based on Electrostatic Affinity Nanotransporter and Cell Imaging

The present invention discloses a non-enzymatic detection method of intracellular microRNA based on electrostatic affinity nano-transporter and cell imaging. The present invention adopts a non-enzymatic amplification system, designs specific DNA hairpin probes H1 and H2 sequences with fluorescent labels for detecting target microRNA sequences, assembles H1, H2 and gold nanoparticles into complexes and transports them to cancer cells, when the amplification system contains microRNA to be tested, it can bind to H1, which results in H1 stem opening, and part of the single-chain structure produced by the system interacts with H2, leading to H2. When the stem is opened, the distance between the fluorescent group FAM and quenched group BHQ_1 increases, and the fluorescence intensity increases. Fluorescence intensity was measured by fluorescence spectrophotometer, and intracellular imaging was recorded by laser scanning confocal microscopy. The method has the advantages of simple principle and low detection cost, constant temperature and no enzyme amplification, high sensitivity, simple operation and easy popularization.

【技术实现步骤摘要】
基于静电亲和纳米转运载体及细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法
本专利技术属于核酸检测
，特别涉及一种基于静电亲和纳米转运载体的胞内microRNA非酶扩增检测方法及其在细胞成像中的应用。
技术介绍
microRNA(miRNA)是高度保守的、长度为18-25nt的、由非编码内源性基因编码的微小单链RNA。迄今为止，miRNA在基因表达调控中的功能机制受到极大的关注，研究表明，miRNA参与众多重要的细胞活动，包括早期发育、病毒防御、器官发育与形成、细胞增殖和凋亡等。另外，它们的表达水平与多种癌症直接相关，可以反映癌基因或抑癌基因的表达情况。因此，miRNA可以作为细胞水平研究和相关疾病的有价值的生物标志物，其中为阐明细胞过程中的复杂功能而对活细胞中天然miRNA信息的揭示已成为miRNA生物学功能研究的热门话题。因此，可视化活细胞中天然miRNA的创新策略可以显著影响miRNA生物学的研究。然而，由于细胞中miRNA的低表达水平和体内复杂的环境，在活细胞中miRNA的原位监测和示踪仍面临着巨大的挑战。作为第一代活细胞成像技术，荧光原位杂交(FISH)测定法监测细胞、组织和模型动物中的核酸已成为细胞生物学中的常用方法，并已被应用于mRNA的成像。尽管基于FISH的技术在广泛的研究领域中是有效的，但探针的单个荧光发光体不能满足低浓度靶标的要求。迄今为止，已经开发了一些基于探针的改进的体内杂交技术，这些技术开拓了细胞成像领域的新策略。特别地，基于分子信标(MB)的方法构建了高信噪比策略，其已应用于mRNA分析和分子感测。MB的引入通过茎环结构实现特定的DNA或RNA监测和跟踪，实现了高效率和高信噪比。但是，灵敏度仍受单荧光发光体的限制。因此，专利技术人通过提高核酸进入细胞的荧光产量、探针稳定性和转移效率来改善这些局限性。通过优化的反应条件，核酸探针可以显著提高荧光产量，并获得更高的荧光强度。专利技术人前期专利(中国专利：201410768156.4)公开了一种目标触发的指数级非酶扩增平台，它通过两个发夹探针的循环相互作用实现，采用这种策略对荧光信号进行放大可显著提高灵敏度。因此，专利技术人有将其应用于活细胞中miRNA的细胞内成像的想法。重要的是，将两个发夹探针递送到活细胞中的效率也是细胞成像过程中的重要因素。此前，随着纳米技术的发展与普及，纳米金颗粒(AuNPs)作为载体用于药物、基因转运越来越备受关注，并大大提高了转运效率。因此，我们构建了电荷负载的AuNPs载体以进行靶标触发的非酶扩增的细胞内转运，其通过DNA探针的自组装实现信号放大，并可应用于活细胞成像。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种基于静电亲和纳米转运载体和细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法，并将其应用于活细胞成像。该方法是通过荧光信号增强非酶扩增平台并结合纳米转运载体用于细胞胞内microRNA痕量检测。该方法灵敏度高、特异性好、准确、快速、操作简单，且整个扩增过程不需要酶的参与。因此，本专利技术在降低了检测成本的基础上，为microRNA检测技术体系提供了一种全新的microRNA检测方法。本专利技术的基本原理如图1所示：本专利技术的扩增过程由非酶扩增反应构成，“信号给出”步骤采用荧光信号模式。首先，针对检测目标microRNA序列设计特异性的DNA发卡探针H1、H2序列，其中H1的5′端和3′端分别标记荧光基团FAM、淬灭基团BHQ-1，H2的3′端标记荧光基团FAM，从5′端起第8个碱基T标记淬灭基团BHQ-1；当扩增体系不存在待测microRNA时，扩增反应不会被激活，发卡探针之间不能发生反应，因此，发卡探针不会被打开仍是发卡结构，荧光基团FAM与淬灭基团BHQ-1相互作用，荧光处于淬灭状态；当扩增体系中含有待测microRNA，待测microRNA可与发卡探针H1结合，导致H1茎部打开，由此产生的部分单链结构与H2相作用，导致发卡探针H2茎部打开，并与H1形成H1+H2双链复合结构，由此荧光基团FAM与淬灭基团BHQ-1距离增大，荧光强度增加。再者，将发卡探针H1、H2与纳米金颗粒组装成复合体，并转运至细胞内，因肿瘤细胞高表达microRNA，因此触发非酶扩增，发卡探针H1、H2打开，荧光强度增加。最后用荧光分光光度计检测胞外非酶扩增荧光强度，并用激光扫描共聚焦显微镜记录细胞胞内成像情况。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于静电亲和纳米转运载体和细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法，包括以下步骤：(1)纳米金颗粒(AuNPs)的合成纳米金颗粒(AuNPs)的合成包括以下步骤：a、纳米金颗粒合成体系有PBS缓冲液、聚-L-赖氨酸PLL溶液、氯金酸溶液，最后加入无核酸酶水将体积补至体系所需体积，充分振荡混匀，全程避光；b、将步骤a所得溶液瞬时离心，使管盖沾粘的溶液落于管中，全程避光；c、将步骤b所得溶液放于恒温混匀仪中，恒温避光孵育；d、待步骤c溶液由黄色变为红色，指示纳米金颗粒的形成，放入4℃冰箱保存；(2)用于非酶扩增体系发卡探针的设计根据非酶扩增原理及待测microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡探针H1及发卡探针H2序列：发卡探针H1采用双头标记策略，其5′端和3′端分别标记荧光基团FAM、淬灭基团BHQ-1；H2的3′端标记荧光基团FAM，从5′端起第8个碱基T标记淬灭基团BHQ-1；发卡探针H1、H2用TE缓冲液溶解即可，终浓度均为100μM，保存于-20℃冰箱；(3)发卡探针预处理为了使发卡探针H1、H2充分形成发卡结构，向发卡探针H1、H2溶液中分别加入磷酸盐缓冲液PBS，并将PBS终浓度设置为1×；随后，加热至95℃之后，使其充分变性；最后，梯度降温，降至常温为止，分别得到发卡探针H1、H2的预处理产物，产物保存于4℃或-20℃环境中备用；H1、H2形成充分的发卡结构后，荧光基团FAM与淬灭基团BHQ-1相互作用，荧光淬灭；(4)胞外非酶扩增检测体系的构建取一定量步骤(3)中得到的发卡探针H1、H2的预处理产物，并加入PBS缓冲液，再加入RNA酶抑制剂，最后加DEPC水至检测体系所需体积，充分混匀；(5)胞外非酶扩增检测体系的验证及其灵敏度、特异性检测分别在步骤(4)非酶扩增检测体系中加入不同浓度的待测microRNA，温浴，用荧光分光光度计检测所得溶液的荧光强度，并确定非酶扩增体系的灵敏度；设置Control组，然后分别在步骤(4)非酶扩增检测体系中加入相同浓度的待测microRNA，以及与其碱基序列类似的microRNA210、microRNA214，温浴，用荧光分光光度计检测所得溶液的荧光强度，并确定非酶扩增体系的特异性；(6)非酶扩增纳米金颗粒转运体系的构建取一定量步骤(3)中得到的发卡探针H1、H2的预处理产物，加入到步骤(1)所得的AuNPs溶液中，充分混匀后，温浴；(7)肿瘤细胞非酶扩增纳米金复合体的转运取一定量步骤(6)所得溶液，加入到肿瘤细胞中，随后放到37℃二氧化碳培养箱中孵育，至少1小时；(8)细胞核与骨架的染色将步骤(7)中孵育过后的产物从二氧化碳培养箱中取出，然后进行细胞核与骨架的染色，再进行显微镜观察，或放入4℃冰箱避光保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于静电亲和纳米转运载体及细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)纳米金颗粒(AuNPs)的合成纳米金颗粒(AuNPs)的合成包括以下步骤：a、纳米金颗粒合成体系有PBS缓冲液、聚‑L‑赖氨酸PLL溶液、氯金酸溶液，最后加入无核酸酶水将体积补至体系所需体积，充分振荡混匀，全程避光；b、将步骤a所得溶液瞬时离心，使管盖沾粘的溶液落于管中，全程避光；c、将步骤b所得溶液放于恒温混匀仪中，恒温避光孵育；d、待步骤c溶液由黄色变为红色，指示纳米金颗粒的形成，放入4℃冰箱保存；(2)用于非酶扩增体系发卡探针的设计根据非酶扩增原理及待测microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡探针H1及发卡探针H2序列：发卡探针H1采用双头标记策略，其5′端和3′端分别标记荧光基团FAM、淬灭基团BHQ‑1；H2的3′端标记荧光基团FAM，从5′端起第8个碱基腺嘌呤T标记淬灭基团BHQ‑1；发卡探针H1、H2用TE缓冲液溶解即可，终浓度均为100μM，保存于‑20℃冰箱；(3)发卡探针预处理为了使发卡探针H1、H2充分形成发卡结构，向发卡探针H1、H2溶液中分别加入磷酸盐缓冲液PBS，并将PBS终浓度设置为1×；随后，加热至95℃之后，使其充分变性；最后，梯度降温，降至常温为止，分别得到发卡探针H1、H2的预处理产物，产物保存于4℃或‑20℃环境中备用；H1、H2形成充分的发卡结构后，荧光基团FAM与淬灭基团BHQ‑1相互作用，荧光淬灭；(4)胞外非酶扩增检测体系的构建取一定量步骤(3)中得到的发卡探针H1、H2的预处理产物，并加入PBS缓冲液，再加入RNA酶抑制剂，最后加DEPC水至检测体系所需体积，充分混匀；(5)胞外非酶扩增检测体系的验证及其灵敏度、特异性检测分别在步骤(4)非酶扩增检测体系中加入不同浓度的待测microRNA，温浴，用荧光分光光度计检测所得溶液的荧光强度，并确定非酶扩增体系的灵敏度；设置Control组，然后分别在步骤(4)非酶扩增检测体系中加入相同浓度的待测microRNA以及与待测microRNA碱基序列类似的microRNA210、microRNA214，温浴，用荧光分光光度计检测所得溶液的荧光强度，并确定非酶扩增体系的特异性；(6)非酶扩增纳米金颗粒转运体系的构建取一定量步骤(3)中得到的发卡探针H1、H2的预处理产物，加入到步骤(1)所得的AuNPs溶液中，充分混匀后，温浴；(7)肿瘤细胞非酶扩增纳米金复合体的转运取一定量步骤(6)所得溶液，加入到肿瘤细胞中，随后放到37℃二氧化碳培养箱中孵育，至少1小时；(8)细胞核与骨架的染色将步骤(7)中孵育过后的产物从二氧化碳培养箱中取出，然后进行细胞核与骨架的染色，再进行显微镜观察，或放入4℃冰箱避光保存；(9)细胞荧光强度的检测与胞内成像将步骤(8)中所得最终产物，用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞胞内成像情况，并记录数据。...

【技术特征摘要】
1.一种基于静电亲和纳米转运载体及细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)纳米金颗粒(AuNPs)的合成纳米金颗粒(AuNPs)的合成包括以下步骤：a、纳米金颗粒合成体系有PBS缓冲液、聚-L-赖氨酸PLL溶液、氯金酸溶液，最后加入无核酸酶水将体积补至体系所需体积，充分振荡混匀，全程避光；b、将步骤a所得溶液瞬时离心，使管盖沾粘的溶液落于管中，全程避光；c、将步骤b所得溶液放于恒温混匀仪中，恒温避光孵育；d、待步骤c溶液由黄色变为红色，指示纳米金颗粒的形成，放入4℃冰箱保存；(2)用于非酶扩增体系发卡探针的设计根据非酶扩增原理及待测microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡探针H1及发卡探针H2序列：发卡探针H1采用双头标记策略，其5′端和3′端分别标记荧光基团FAM、淬灭基团BHQ-1；H2的3′端标记荧光基团FAM，从5′端起第8个碱基腺嘌呤T标记淬灭基团BHQ-1；发卡探针H1、H2用TE缓冲液溶解即可，终浓度均为100μM，保存于-20℃冰箱；(3)发卡探针预处理为了使发卡探针H1、H2充分形成发卡结构，向发卡探针H1、H2溶液中分别加入磷酸盐缓冲液PBS，并将PBS终浓度设置为1×；随后，加热至95℃之后，使其充分变性；最后，梯度降温，降至常温为止，分别得到发卡探针H1、H2的预处理产物，产物保存于4℃或-20℃环境中备用；H1、H2形成充分的发卡结构后，荧光基团FAM与淬灭基团BHQ-1相互作用，荧光淬灭；(4)胞外非酶扩增检测体系的构建取一定量步骤(3)中得到的发卡探针H1、H2的预处理产物，并加入PBS缓冲液，再加入RNA酶抑制剂，最后加DEPC水至检测体系所需体积，充分混匀；(5)胞外非酶扩增检测体系的验证及其灵敏度、特异性检测分别在步骤(4)非酶扩增检测体系中加入不同浓度的待测microRNA，温浴，用荧光分光光度计检测所得溶液的荧光强度，并确定非酶扩增体系的灵敏度；设置Control组，然后分别在步骤(4)非酶扩增检测体系中加入相同浓度的待测microRNA以及与待测microRNA碱基序列类似的microRNA210、microRNA214，温浴，用荧光分光光度计检测所得溶液的荧光强度，并确定非酶扩增体系的特异性；(6)非酶扩增纳米金颗粒转运体系的构建取一定量步骤(3)中得到的发卡探针H1、H2的预处理产物，加入到步骤(1)所得的AuNPs溶液中，充分混匀后，温浴；(7)肿瘤细胞非酶扩增纳米金复合体的转运取一定量步骤(6)所得溶液，加入到肿瘤细胞中，随后放到37℃二氧化碳培养箱中孵育，至少1小时；(8)细胞核与骨架的染色将步骤(7)中孵育过后的产物从二氧化碳培养箱中取出，然后进行细胞核与骨架的染色，再进行显微镜观察，或放入4℃冰箱避光保存；(9)细胞荧光强度的检测与胞内成像将步骤(8)中所得最终产物，用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞胞内成像情况，并记录数据。2.根据权利要求1所述的一种基于静电亲和纳米转运载体及细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法，其特征在于：所述纳米金颗粒合成的详细步骤如下：a、取30mgPLL溶于3mL水中，充分振荡混匀5min使其全部溶解，配制成浓度为10mg/mL的PLL溶液，放入-20℃低温冰箱保存；b、取10uL原浓度为1.52mol/L的氯金酸溶液，加入142uL水中，充分混匀，避光配制成浓度为0.1mol/L的氯金酸溶液，放入4℃冰箱避光保存；c、取20×PBS50uL，同时取步骤a所得溶液60uL，步骤b所得溶液10uL，加入880uL无核酸酶水补至1mL，充分振荡混匀，全程避光；d、将步骤c所得溶液瞬时离心，使管盖沾粘的溶液落于管中，全程避光；e、将步骤d所得溶液放于恒温混匀仪中，300rpm、66℃恒温孵育3小时，全程避光；f、待步骤e溶液由黄色变为红色，指示纳米金颗粒的形成，放入4℃冰箱保存。3.根据权利要求1所述的一种基于静电亲和纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄曦，廖玉辉，赵钊艳，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：广东,44