一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，包括将多重链置换扩增反应体系置于琼脂糖凝胶中，在凝胶的网格状结构中，完成对目标基因组的全基因组扩增。凝胶状态的琼脂糖形成网格状结构，将多重链置换扩增反应体系相对分隔于微小的反应空间中，各微观反应单元之间的物质交换和相互影响大为减少，因此各微观反应单元以一个相对独立的状态发生反应，目标核酸各个片段之间的扩增一致性得到很大提升。同时，基于琼脂糖凝胶介质的多重链置换扩增，不需要预先制备微液滴发生装置或复杂反应微腔，并且在系统调试和扩增反应的过程中，不需要对微量液体进行精密和复杂的控制，简化了反应系统，降低了操作复杂度。

A genome-wide amplification method based on agarose gel medium

The invention discloses a genome-wide amplification method based on agarose gel medium, including placing the multiple strand displacement amplification reaction system in agarose gel, and completing the whole genome amplification of the target genome in the gel grid structure. The agarose in gel state forms a grid structure, which separates the multiple strand displacement amplification reaction system from the small reaction space. The material exchange and interaction between the microscopic reaction units are greatly reduced. Therefore, the microscopic reaction units react in a relatively independent state, and the consistency of the target nucleic acid fragments is greatly improved. At the same time, the multiple strand displacement amplification based on agarose gel medium does not require the preparation of micro droplet generation device or complex reaction microcavity in advance, and in the process of system debugging and amplification reaction, it does not need precise and complex control of the micro liquid, simplifying the reaction system and reducing the operational complexity.

【技术实现步骤摘要】
一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法
本专利技术涉及一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，属于全基因组扩增

技术介绍
全基因组扩增(Wholegenomeamplification，WGA)是一种增加有限的DNA样本的数量的扩增方法。早期的WGA是基于聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)的技术，如简并寡聚核苷酸PCR(DOP–PCR)、引物延伸预扩增(PEP)以及适配子连接PCR等。在这些技术中使用的TaqDNA聚合酶，将片段大小限制在3kb，并且在序列中引入了很多错误。此外，这些技术不能完整地覆盖基因组，并且扩增是有偏性的。近十几年来，使用随机六聚物与变性的DNA结合，然后在恒定的温度下，利用Phi29聚合酶进行链置换合成的多重链置换反应(Multipledisplacementamplification，MDA)，成为全基因组扩增的主流方法，特别是能满足构建高通量DNA测序文库的需要。多重链置换反应产生的DNA片段长达100kb，可以完成对低起始量样本的准确且一定程度上的均匀扩增，但依然存在基因组内的扩增均一性较差，对基因组之间的杂合信息分辨率低等不足。一些研究者将这两种方法混合使用，例如MALBAC(Science,2012,338:1627-1630)和PicoPLEX，在扩增的早期阶段采用随机引物和变温预扩增，后期采用聚合酶链式反应进行扩增的方法，但限制反应的循环数。然而这种混合并没有解决多重链置换反应的不足，与单纯使用PCR和MDA方法比较起来，这些方法也仅仅获得了中间效果。也有一些基于微流控装置或微液滴的多重链置换扩增方法随后被开发出来，以改善传统多重链置换扩增方法在扩增均一性上的不足。Quake等人将传统的发生在离心管内的多重链置换反应转移到纳升的微流控反应微腔中(PLoSgenetics,2007,3:1702-1708)，证实可以改善扩增反应的偏好性(bias)；在另一些报道中，多重链置换反应体系被转移进微液滴环境中(PNAS,2015,112:11923-11928；Nucleicacidsresearch,2016,44:e66)，结果表明这些扩增偏好会在一定程度上得到抑制。然而，反应微腔的制备和操作较为复杂，依赖精密的设备和精巧的操作，且费用较为高昂，从零散的材料和设备开始构建整个系统费时费力。将多重链置换扩增转移进油水混合的乳液环境同样对设备和操作的依赖性极大，商业化微液滴发生器机器配件价格较高，并且制备微乳液使用的表面活性剂在一定程度上影响反应的进行。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，其通过琼脂糖凝胶形成的网格结构，将全基因扩增体系置于这种结构稳定的微小空间中，提升扩增的均一性，简化系统和实验流程，降低花费。技术方案：为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，包括将多重链置换扩增反应体系置于琼脂糖凝胶中(即置于琼脂糖溶液中，待琼脂糖溶液冷却为琼脂糖凝胶后)，在凝胶的网格状结构中，完成对目标基因组的全基因组扩增。所述的多重链置换扩增，是采用具有链置换能力的核酸聚合酶和随机序列引物，在恒温的条件下，对目标基因组核酸片段进行扩增，提高其绝对质量。所述的具有链置换能力的核酸聚合酶，包括Φ29DNA聚合酶、KlenowDNA聚合酶或BstDNA聚合酶等具有链置换能力的聚合酶。所述的随机序列引物，其长度为5-40个碱基，其中包含一个或多个简并碱基，可以为普通未修饰引物，也可以为经过硫代修饰、硫酸化修饰或氨基修饰等的修饰引物。所述的琼脂糖凝胶，是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶，具有网状结构，琼脂糖的质量百分比在0.1％-5.0％之间。所述的琼脂糖，在高于熔胶温度时溶解于水形成透明的水溶液，在低于胶凝温度时，琼脂糖水溶液凝固成凝胶状态，在温度高于熔胶温度时，凝胶再次熔化为溶液状态，凝胶状态与溶液状态是可逆的。其可以是普通的琼脂糖，也可以是低熔点琼脂糖或超低凝固点琼脂糖。所述的网状结构，是琼脂糖凝胶中依靠糖基间的氢键引力形成网状结构，其网孔大小取决于琼脂糖浓度。所述的目标基因组，为一种或多种人类、动物、植物或微生物的基因组，目标基因组的规模，可以为单细胞基因组或多细胞基因组。本专利技术采用多重链置换扩增方法，完成对目标基因组的全基因组扩增。多重链置换扩增采用Φ29、Bst和Klenow等DNA聚合酶，在恒温的条件下，利用随机序列引物对目的核酸片段进行大量高效的扩增，可以实现飞克(fg)量级核酸或单个细胞基因组的有效扩增，满足后续的核酸检测、DNA测序等应用的要求，具有较高的扩增效率和保真性，使用较为广泛。本专利技术将多重链置换扩增反应体系置于琼脂糖凝胶的网格结构中，并在该微小空间内完成扩增反应。网格形的琼脂糖凝胶将多重链置换扩增反应体系相对分隔于一个微小的反应空间中，各微观反应单元之间的物质交换和相互影响大为减少，因此各微观反应单元以一个相对独立的状态发生反应，目标核酸各个片段之间的扩增一致性得到很大提升。同时，琼脂糖凝胶的网格结构，允许小分子量的离子在反应体系内扩散，对局部反应单元的离子消耗给予相对及时的补充，保证了反应体系的扩增效率不受影响。琼脂糖是非离子型多糖，由1,3-交联的D-半乳糖和1,4-交联的脱水α-L-半乳糖交替组成。普通琼脂糖在室温下难溶于水，温度升到85℃以上时溶解于水中，该溶液在低于45℃时会形成乳白色的凝胶，而该凝胶在温度高于85℃时又会溶解成为溶液。凝胶是一种特殊的分散结构，一般由高分子构成的弹性交联网络结构和充满其内部空间的流体组成。与溶液相比，凝胶介质中离子对流受到抑制，扩散速率也很低。琼脂糖凝胶网络结构的孔尺寸可通过改变交联密度进行调节：高交联密度凝胶的孔尺寸在几纳米范围；而低交联密度的凝胶中可能存在很大的孔，如1％琼脂糖凝胶的孔可大至140nm左右。有益效果：相对于现有技术，本专利技术方法具有以下优势：1)基于琼脂糖凝胶介质的多重链置换扩增，因为琼脂糖凝胶将待扩增的DNA模板和反应体系分散于一个网格状的空间结构中，各个具体的扩增反应单元彼此相对孤立，包括聚合酶和引物在内的大分子交换较少，以一个近乎独立的状态进行扩增，缓解了部分反应单元的扩增过度和扩增不足，从而极大地提高了整个多重链置换反应的扩增均一性。2)基于琼脂糖凝胶介质的多重链置换扩增，不需要预先制备微液滴发生装置或复杂反应微腔，并且在系统调试和扩增反应的过程中，不需要对微量液体进行精密和复杂的控制，与微液滴多重链置换扩增和基于微流控反应微腔的多重链置换扩增相比，极大地简化了反应系统，降低了操作复杂度。3)基于琼脂糖凝胶介质的多重链置换扩增，不需要使用微液滴多重链置换扩增体系所需的矿物油、表面活性剂等组分，避免了这些组分对扩增反应体系的干扰。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术方法进行进一步说明。实施例1：利用琼脂糖凝胶介质扩增YH-1永生化细胞样本：10ng人类永生态细胞系YH-1基因组DNA。PCR离心管中加入5nmol的N6随机序列引物，序列为5’-NNNN-s-N-s-N-3’，其中第4和第5位碱基的3’端经硫代修饰处理，Φ29DNA聚合酶反应缓冲液，定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，其特征在于，包括将多重链置换扩增反应体系置于琼脂糖凝胶中，完成对目标基因组的全基因组扩增。

【技术特征摘要】
1.一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，其特征在于，包括将多重链置换扩增反应体系置于琼脂糖凝胶中，完成对目标基因组的全基因组扩增。2.根据权利要求1所述的基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，其特征在于，所述多重链置换扩增，是采用具有链置换能力的核酸聚合酶和随机序列引物，在恒温的条件下，对目标基因组核酸片段进行扩增，提高其绝对质量。3.根据权利要求2所述的基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，其特征在于，所述具有链置换能力的核酸聚合酶，是Φ29DNA聚合酶，KlenowDNA聚合酶或BstDNA聚合酶。4.根据权利要求2所述的基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂景，苏奥，马靖原，黄梦婷，杨芳，陆祖宏，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32