交叉引物扩增结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种交叉引物扩增技术结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法，所述方法的交叉引物扩增体系中不仅有前置换引物4s、核心交叉引物2s、扩增引物3a、扩增引物1a、后置换引物5a，以及上述引物任选其一标记半抗原的引物，并在生物素化的dCTP、南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶的存在下进行恒温扩增，最后使用包被有亲和素化高分子纳米粒子的生物传感器检测扩增产物。本发明专利技术还提供了一组用于上述方法检测肺炎克雷伯菌的rcsA基因的一组核苷酸序列引物组合。本发明专利技术提供的方法简便、快速、能够有效去除交叉污染，具有优异的灵敏度，最低可检测到2×10

Detection of nucleic acid by cross-primer amplification combined with Nano-biosensor and AUDG

The invention discloses a method for detecting nucleic acid by cross primer amplification technology combined with Nano-biosensor and AUDG. The cross primer amplification system of the method includes not only pre-replacement primer 4s, core cross primer 2s, amplification primer 3a, amplification primer 1a, post-replacement primer 5a, and the primers of the above-mentioned primers can select one of their marker hapten primers optionally, but also in biotinylated dCTP, Antarctic heat. Amplification was carried out at constant temperature in the presence of uracil deoxyribonucleic acid glycosylase. Finally, the amplified products were detected by a biosensor coated with avidin-coated macromolecule nanoparticles. The invention also provides a set of primer combinations for detecting the rcsA gene of Klebsiella pneumoniae by the above method. The method provided by the invention is simple, fast and can effectively remove cross-contamination, has excellent sensitivity, and can detect a minimum of 2*10.

【技术实现步骤摘要】
交叉引物扩增结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法
本专利技术公开了一种核酸恒温扩增方法，属于分子生物检测领域。
技术介绍
在当代生物学和医学领域，核酸扩增是一种必不可少的生物技术。核酸扩增技术已经广泛运用于临床诊断、基础研究、流行病研究、转基因研究、考古研究等领域。在已经发展的核酸扩增技术中，聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义。PCR技术已经广泛运用于生物及医学相关领域。然而，运用PCR技术及PCR相关技术(如实时PCR,多重PCR)进行核酸扩增时，受到实验室条件的限制，依赖于复杂昂贵的热循环仪器。除此之外，PCR结果的判定(即扩增产物的检测)比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。这些劣势限制了该技术的广泛应用，尤其在经济落后的地区及快速诊断领域。因此，对于生物及医学相关研究领域而言，非常有必要发展简单、快速、敏感的核酸扩增方法。为了克服PCR相关扩增技术的劣势，应运而生了许多恒温扩增技术。与PCR相关技术比较，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度较快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，现场诊断及便捷检测。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有环介导恒温扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CPA)、多交叉置换扩增(MCDA)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)等。在这些恒温扩增技术中，CPA作为一种设计简单，检测敏感的技术，已经广泛地运用到细菌、病毒、真菌及寄生虫检测及鉴定。CPA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。交叉引物扩增(CPA)的技术瓶颈在结果的判定，即扩增产物的检测。到目前为止，最常见的产物检测手段主要包括颜色指示剂，电泳，实时浊度。然而，这三种检测技术仅仅适用于单重检测(即单一靶标的检测)。此外，应用颜色指示剂判读CPA扩增产物时，会出现模棱两可的结果；电泳判读CPA结果时耗时较长，容易出现交叉污染，不适合于现场检测；实时浊度判读CPA结果时需要特殊的仪器设备。为了克服这三种检测技术的劣势，使CPA扩增技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。近期，一些研究以CPA为基础，将CPA扩增技术与生物传感技术相结合，开发了依赖CPA技术、实现快速，敏感检测的生物传感技术。为了将CPA扩增产物适用于生物传感技术，传统的策略是在CPA扩增体系中同时添加两条标记的引物，一条引物在5’端标记生物素，另一条引物在5’端标记半抗原。当CPA扩增完毕，双标的扩增产物被构建(该双标的产物起源于两条标记的引物)，一端标记生物素，另一端标记半抗原。然而，传统策略构建双标记的CPA产物容易导致假阳性结果，甚至不需要扩增就能导致假阳性结果。该假阳性结果来源于标记引物之间的杂交。因此，为了克服传统标记策略的劣势，本专利技术设计了一种新的检测策略，该技术只需一条标记的引物就能构建双标的扩增产物，从而将扩增产物适用于生物传感技术。为了将CPA扩增产物适用于生物传感技术的检测，打开CPA反应管是一个必须的步骤，然而，该步骤导致大量的扩增产物以气溶胶的形式挥发，从而导致交叉污染，产生假阳性结果。为了克服传统标记策略，交叉污染导致的假阳性结果，在本专利技术中，专利技术人利用单标记的引物和南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶，以CPA技术为基础，开发了CPA结合纳米传感及南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶核酸诊断技术(Cross-primingamplificationcombinedwithnanoparticles-basedlateralflowbiosensor,antarcticthermalsensitiveuracil-DNA-glycosylasefordetectionofnucleicacidandpreventionofcarryovercontamination；CPA-AUDG-LFB)。为了验证CPA-AUDG-LFB技术的可行性，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae)被应用于CPA-AUDG-LFB技术，建立检测K.pneumoniae的CPA-AUDG-LFB方法。
技术实现思路
基于上述目的，本专利技术首先提供了一种交叉引物扩增技术结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的核酸；(2)提供前置换引物4s、核心交叉引物2s、扩增引物3a、扩增引物1a以及后置换引物5a，另外，还提供在5’端被标记半抗原的上述任选的一种引物，命名为4s*、2s*、3a*、1a*或者5a*；(3)在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型DNA聚合酶Bst、引物、dNTP，以及生物素化的dCTP(Biotin-14-dCTP)存在下，使用待检测样品的核酸作为模板进行交叉引物扩增DNA；(4)使用包被有亲和素化高分子纳米粒子的生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。在一个优选的实施方案中，所述被标记的引物为3a*。在一个更为优选的实施方案中，所述被标记的半抗原为FITC。更为优选地，，所述高分子纳米生物传感器包括一背板1，在所述背板1上依次设置装有样品板2、结合板3、硝酸纤维素膜4及吸水板5，在所述硝酸纤维素膜4上依次设置检测线41及控制线42，在结合板3、检测线41、及控制线42区域依次包被有色基团修饰的，亲和素化的高分子纳米粒子6、抗FITC抗体7及生物素偶联的牛血清蛋白8。在一个优选的实施方案中，步骤(3)所述扩增的温度为63-65℃。在一个更为优选的实施方案中，步骤(3)所述扩增的温度为64℃。在一个优选的实施方案中，所述扩增的目的基因为K.pneumonia的rcsA。在一个更为优选的实施方案中，所述前置换引物4s的序列如SEQID.NO.1所示，核心交叉引物2s的序列如SEQID.NO.2所示，扩增引物3a的序列如SEQID.NO.3所示，扩增引物1a的序列如SEQID.NO.4所示，以及后置换引物5a的序列如SEQID.NO.5所示。其次，本专利技术还提供了一组用于多交叉引物恒温扩增K.pneumonia的rcsA基因的引物，所述引物包括：序列如SEQID.NO.1所示的前置换引物4s，序列如SEQID.NO.2所示的核心交叉引物2s，序列如SEQID.NO.3所示的扩增引物3a，序列如SEQID.NO.4所示的扩增引物1a，以及序列如SEQID.NO.5所示的后置换引物5a。本专利技术提供的方法简便、快速，全部扩增可以在63-65℃的恒温环境下完成，反应时间仅为1小时。AUDG的加入能够有效去除交叉污染。在对K.pneumoniae菌的检测中，本专利技术显示了优异的灵敏度，最低可检测到2×101拷贝/微升(100fg)，在对23株K.pneumoniae菌和21株非K.pneumoniae菌的检测中显示了100％的特异性。附图说明图1.针对rcsA基因设计CPA引物的设计示意图；图2.CPA扩增原理示意图；图3.高分子纳米生物传感器结构及检测流程示意图；图4.CPA引物验证结果图谱；图5.CPA引物最佳温度检测结果图谱；图6.CPA-LFB方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种交叉引物扩增技术结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的核酸；(2)提供前置换引物4s、核心交叉引物2s、扩增引物3a、扩增引物1a以及后置换引物5a，另外，还提供在5’端被标记半抗原的上述任选的一种引物，命名为4s*、2s*、3a*、1a*或者5a*；(3)在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型DNA聚合酶Bst、引物、dNTP，以及生物素化的dCTP存在下，使用待检测样品的核酸作为模板进行交叉引物扩增DNA；(4)使用包被有亲和素化高分子纳米粒子的生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。

【技术特征摘要】
1.一种交叉引物扩增技术结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的核酸；(2)提供前置换引物4s、核心交叉引物2s、扩增引物3a、扩增引物1a以及后置换引物5a，另外，还提供在5’端被标记半抗原的上述任选的一种引物，命名为4s*、2s*、3a*、1a*或者5a*；(3)在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型DNA聚合酶Bst、引物、dNTP，以及生物素化的dCTP存在下，使用待检测样品的核酸作为模板进行交叉引物扩增DNA；(4)使用包被有亲和素化高分子纳米粒子的生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被标记的引物为3a*。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述被标记的半抗原为FITC。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子纳米生物传感器包括一背板(1)，在所述背板(1)上依次设置装有样品板(2)、结合板(3)、硝酸纤维素膜(4)及吸水板(5)，在所述硝酸纤维素膜(4)上依次设置检测线(41)及控制线(42)，在结合板(3)、检测线(41)、及控制线(42)区域依...

【专利技术属性】
技术研发人员：申阿东，王毅，孙琳，李洁琼，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京儿童医院，
类型：发明
国别省市：北京,11