酸性植酸酶ＡＰＰＡ，其突变体及其制备制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种来源于细菌Ｙｅｒｓｉｎｉａｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ的植酸酶ＡＰＰＡ及其基因、该植酸酶的单氨基酸位点突变体ＡＰＰＡ－Ｓ２２Ｔ及其编码基因，以及包含该基因的重组载体和应用。本发明专利技术提供了一种新植酸酶ＡＰＰＡ，其氨基酸序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ．１所示，且本发明专利技术提供了编码上述植酸酶的基因ａｐｐａ。本发明专利技术获得一种植酸酶，其最适ｐＨ值为２．５，其适应饲喂动物胃肠道环境的能力优于目前应用的植酸酶。本发明专利技术还获得该植酸酶的单氨基酸位点突变体ＡＰＰＡ－Ｓ２２Ｔ，其最适ｐＨ值变为４．５，且其比活、ｐＨ稳定性和热稳定性都有所提高，这些性质使其在饲料中具有更广泛的应用和更高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
,其突变体及其制备的制作方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种植酸酶APPA，其单氨基酸位点 突变体，编码该酶和突变体的基因、及包含这些基因的重组载体和应用。
技术介绍
磷是一种所有动物生长都需要的重要矿物质。在动物日粮中提供充足的磷是非常 重要的。长期磷缺乏会导致生长动物的佝偻病和成年动物的骨质疏松症，从而影响动物的 生长性能。目前在动物饲料中添加无机磷如磷酸氢钙来满足动物对磷的需求。但是在主要 以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷，只不过是因为它们主要以动物不能 利用的植酸磷的形式存在而已。 植酸磷是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达 1-5% ，它占植物中总磷的60-80% 。但是，以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能 分解植酸的酶而难以被利用，其利用率仅在0-40% 。植酸磷不能被动物有效利用，从而在饲 喂过程中造成了许多问题，第一、造成磷源浪费，一方面饲料中的磷源不能得到有效利用， 另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中额外添加无机磷，提高了饲料成本。在 实际生产中，添加无机磷时还常因无机磷中残留有氟、重金属等元素而造成动物中毒。第 二、形成高磷粪便而污染环境，饲料中85%左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大 量的磷使水和土壤受到严重污染。因此，防止磷对环境的污染更具有特殊的意义。第三、 植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物肠胃道的消化吸收过程中会与多种金属离子Zn2+、 C^+、Cu"、F^+等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，从而降低了动物对这些营养元素 的有效利用。 植酸酶(EC. 3. 1. 3. 8)是一种能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷 酸。植酸酶广泛存在于微生物中，如枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、酵母及曲霉等。 植酸酶的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。它可使植物性饲料中磷的利用率 提高60% ，粪便中磷排泄量减少40% ，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此对提高畜牧业 生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。 尽管植酸酶的种类和性质多种多样，但是却没有一个真正理想的可用于生产实践 的野生型植酸酶。理论上所谓"理想的"的植酸酶必须具备几个条件催化效率高、抗蛋白酶 水解、很好的热稳定性并且必须价格便宜等。事实上，这种十全十美的植酸酶是根本不存在 的。这种植酸酶虽然不可能从自然界中找到，但是随着基因工程和蛋白质工程的发展，现在 人们把目光转向人为的制造出这种"理想的"植酸酶。并且通过基因操作，已经成功地实现 了植酸酶的一个或多个性质得到改善和提高。基于对不同植酸酶晶体结构的研究，利用点 突变的方法对植酸酶进行改造，来提高A.f咖igatus植酸酶的比活(Tomschy et al. 2000)， 提高E. coli植酸酶的热稳定性(Rodriguez et al. 2000)，提高A. niger植酸酶的pH作用 范围(Mullaney et al. 2002)。 随着饲料工业的发展，新型植酸酶已经成为饲料添加剂和酶制剂研究的热点。重 点的研究方向之一就是通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达植酸酶基因，可 望达到大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能高效应用于动物饲喂的新型植酸酶。 本专利技术的目的之一是提供一种植酸酶APPA，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 本专利技术的目的还在于提供一种核酸分子，其编码权利要求1所述的植酸酶APPA。 实施方式之一中，所述酸分子的序列如SEQ ID NO. 2所示。 本专利技术的目的还在于提供一种植酸酶的单氨基酸位点突变体，其是由植酸酶APPA 氨基酸序列第22位单位点突变形成的。实施方式之一中，所述氨基酸序列第22位处的氨 基酸突变为苏氨酸(图6)。另一实施方式中，所述氨基酸序列如SEQID NO. 3所示。 本专利技术的目的还在于提供一种核酸分子，其编码本专利技术的植酸酶突变体。实施方 式之一中，所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID N0.4所示。 本专利技术还提供了一种核酸分子构建物，其在本专利技术植酸酶APPA或植酸酶突变体 的编码序列之外还包含其它利于其表达和/或分泌的功能元件，此类元件是本领域技术人 员所熟知的，例如信号肽、终止密码子等。例如，信号肽序列可如图6a和6b中划线部分所 示，终止密码子可以是例如taa、tga、tag等常用终止密码子。例如，本专利技术核酸分子构建物 的序列可以如SEQ ID NO. 5(图6a)或SEQ IDN0:6(图6b)所示，其中，前87个核苷酸为信 号肽的编码序列，最后的taa为终止密码子。 本专利技术的目的还在于包含本专利技术各种核酸分子或核酸分子构建物的载体和菌株。 实施方式之一中，所述菌株为大肠杆菌。 本专利技术的目的还在于提供一种制备植酸酶APPA或其突变体的方法，所述方法包 括以下步骤 1)用一种或多种含有本专利技术所述核酸分子的载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；以及 3)回收并纯化所表达的植酸酶或其突变体。 实施方式之一中，本专利技术获得一种植酸酶，其最适pH值为2. 5，其适应饲喂动物胃 肠道环境的能力优于目前应用的植酸酶。且其单氨基酸位点突变体APPA-S22T，其最适pH 值变为4. 5，其比活、pH稳定性和热稳定性都有所提高，这些性质使其在饲料中具有更广泛 的应用和更高的应用价值。附图说明 图1 :在大肠杆菌中表达并纯化的重组植酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M :低分子 量蛋白质标记物(Marker) ;WT :纯化的重组植酸酶APPA ;S22T :纯化的重组植酸酶突变体 APPA-S22T。 图2 :重组植酸酶和突变体的最适pH及比活性。 图3 :重组植酸酶和突变体的pH稳定性。 图4 :重组植酸酶和突变体的最适温度。 图5 :重组植酸酶和突变体的热稳定性。 图6a :—种本专利技术植酸酶APPA的氨基酸序列及其编码序列； 图6b :—种本专利技术植酸酶的单氨基酸位点突变体的氨基酸序列及其编码序列。具体实施方式 实验条件 1、菌株及载体 细菌Yersinia frederiksenii基因组DNA购自军事医学科学院(中国，北京)。 大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)、表达载体pET-22b (+)(购自Novagen公司)。引 物合成由捷瑞公司(中国，上海)完成。 2、酶类及其他生化试剂内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Invitrogen公 司。PNPGal、植酸钠等底物购自Sigma公司，其它都为市售。 3.培养基大肠杆菌培养基为1^(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl， pH7. 0)。 本专利技术中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除 非特别说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括 Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3片反.2001) ;Kriegler， Gene Transfer and Expression :本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植酸酶ＡＰＰＡ，其特征在于，其氨基酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶秀云，周建武，张洋，靳伟刚，罗鋆琳，李仁宽，赖庆安，徐黄兆，
申请(专利权)人：福建福大百特科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]