一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：(1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列；(2)用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段；(3)用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；(4)利用电击法将步骤(3)得到的带有ZmPIF3的质粒转化农杆菌；(5)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；(6)目标植物转基因阳性苗的鉴定；(7)目标植物转基因T2代阳性纯合植株的筛选；(8)转基因纯合植株的抗逆分析。本发明专利技术玉米PIFs家族转录因子基因ZmPIF3提高了转基因植物的耐旱及耐盐能力。

【技术实现步骤摘要】
一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法
本专利技术属于作物遗传育种领域，具体涉及一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法。
技术介绍
全球干旱、半干旱地区约占耕地面积的一半，这些地区水分供应不足，森林植被疏稀，生态环境恶化，水土流失严重，自然灾害频繁。即使在土壤水分充足的情况下，水分亏缺也常常会发生，从而影响到光合作用、物质运输、蛋白质合成和细胞伸长等生理过程。干旱、高盐会造成植物不同程度的脱水，引起植物体内一系列的生理代谢变化，所以又将干旱、高盐等非生物胁迫称为水分胁迫，或渗透胁迫。植物应答渗透胁迫的过程是一个涉及到多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程，大体上可将这些基因及其表达产物分成两类,即功能蛋白和调节蛋白。功能蛋白是指在抵抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质；而调节蛋白是在逆境中参与各种信号转导或调控基因表达，间接起保护作用的蛋白，主要包括：传递信号和调控基因表达的转录因子等。植物在逆境胁迫下可诱导合成大量抗逆的化合物和蛋白质，这些与抗逆境相关的化合物和蛋白质又受转录因子在转录水平上的调控.转录因子可以通过与顺式作用元件结合，启动抗逆相关功能基因的转录，通过抗逆功能基因的表达使植物作出适应逆境胁迫的代谢调整。近年来，在提高作物抗逆性的分子育种中，研究重点已逐渐从改良个别基因转到改良或增强一个或多个发挥关键作用的转录因子上，这样能促使多个功能基因发挥作用，以期获得综合抗逆性状改良的植物。植物PIFs家族转录因子能够与CANNTG序列，又称E-box，发生特异性作用，调节启动子中含E-box元件的功能基因或调控基因的表达，从而参与植物的各种抗逆性反应。目前有关PIFs家族转录因子的研究大部分来自拟南芥，而其它物种的研究报道不多。本专利技术以玉米为研究材料，以拟南芥中的转录因子PIF3为查询序列，同源搜索玉米核苷酸数据库，通过生物信息学的方法找到玉米中的PIF3转录因子基因。目前，缺乏一种对环境影响小的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对环境影响小的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的一种玉米转录因子基因ZmPIF3，其由序列表SEQIDNo.5的核苷酸序列定义。本专利技术的一种玉米转录因子基因ZmPIF3的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQIDNo.6的氨基酸序列定义。本专利技术的一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，是用玉米ZmPIF3基因转化目标植物，获得转基因植物。本专利技术所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：(1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列；(2)用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段；(3)用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；(4)利用电击法将步骤(3)得到的带有ZmPIF3的质粒转化农杆菌；(5)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；(6)目标植物转基因阳性苗的鉴定；(7)目标植物转基因T2代阳性纯合植株的筛选；(8)转基因纯合植株的抗逆分析。进一步地，在步骤(3)中，将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经BglII+EcoRI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收DNA片段，将此片段与相应酶切的p1011载体相连，获得的载体命名为p1011-ZmPIF3。进一步地，在步骤(4)中，将构建好的双元载体p1011-ZmPIF3导入根癌农杆菌中，农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。更进一步地，在步骤(5)中，所述的目标植物是水稻。本专利技术所述的玉米转录因子基因ZmPIF3及其编码蛋白在培育耐旱耐盐的转基因植物中的应用。进一步地，所述转基因植物为玉米或水稻或拟南芥。有益效果：本专利技术的ZmPIF3基因为玉米PIFs家族转录因子基因ZmPIF3,水稻转化的功能分析表明提高了转基因水稻的耐旱及耐盐能力,可用于其他作物的抗逆转基因应用。该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。本专利技术通过对ZmPIF3基因转化水稻进行该基因的功能研究，获得效果如下：(1)获得了对干旱及高盐胁迫有较高耐受性的转基因水稻。(2)ZmPIF3基因具有抵抗干旱和高盐胁迫逆境的功能，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。附图说明图1是本专利技术ZmPIF3的核苷酸序列；图2是本专利技术ZmPIF3的氨基酸序列；图3是本专利技术ZmPIF3与拟南芥PIF3家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对；图4是本专利技术ZmPIF3与拟南芥PIFs转录因子氨基酸序列比对后所作进化树；图5是本专利技术ZmPIF3基因在PEG、NaCl、ABA和低温条件下的诱导表达谱变化情况；图6是本专利技术ZmPIF3转基因水稻T2代纯合株系内荧光定量检测。WT：野生型；VC：空载体；OE1-OE13：ZmPIF3转基因水稻；图7是本专利技术ZmPIF3转基因水稻在溶液中的耐旱性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE3、OE5、OE11：ZmPIF3转基因水稻；图8是本专利技术ZmPIF3转基因水稻在土壤中的耐旱性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE3、OE5、OE11：ZmPIF3转基因水稻；图9是本专利技术ZmPIF3转基因水稻在溶液中的耐盐性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE3、OE5、OE11：ZmPIF3转基因水稻；图10是本专利技术ZmPIF3转基因水稻在土壤中的耐盐性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE3、OE5、OE11：ZmPIF3转基因水稻。具体实施方式本专利技术结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。如图1至图10所示，本专利技术的一种玉米转录因子基因ZmPIF3，其由序列表SEQIDNo.5的核苷酸序列定义。本专利技术的一种玉米转录因子基因ZmPIF3的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQIDNo.6的氨基酸序列定义。本专利技术的一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，是用玉米ZmPIF3基因转化目标植物，获得转基因植物。本专利技术所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：(1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列；本专利技术根据ZmPIF3基因的序列设计如下引物：F：5’-ATGTCCGACAGCAGCGACTTCG-3’SEQIDNO.1，R:5’-TCATGTTTCAGCCTCATTTCTTCC-3’SEQIDNO.2。利用RT-PCR技术从玉米郑单958总cDNA中扩增得到ZmPIF3基因全长cDNA(开放阅读框部分)。经测序表明为PIFs家族转录因子，ZmPIF3的全长cDNA为1941bp，SEQIDNO.5，编码一个由645个氨基酸组成的蛋白，SEQIDNO：6。本专利技术根据ZmPIF3基因的cDNA序列设计如下检测引物：F:5’-CAATCCAGCCACCATTCCC-3’SEQIDNO.3，R:5’-CTGTTGCTCCTGCACCATG-3’SEQIDNO.4。(2)用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段；(3)用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；将含ZmPIF3基因的T/A克隆载体质粒经BglII+Eco本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米转录因子基因ZmPIF3，其特征在于：其由序列表SEQ ID No.5的核苷酸序列定义。

【技术特征摘要】
1.一种玉米转录因子基因ZmPIF3，其特征在于：其由序列表SEQIDNo.5的核苷酸序列定义。2.一种玉米转录因子基因ZmPIF3的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQIDNo.6的氨基酸序列定义。3.一种耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，是用玉米ZmPIF3基因转化水稻，获得转基因植物，所述玉米ZmPIF3基因，其由序列表SEQIDNo.5的核苷酸序列定义。4.根据权利要求3所述的耐旱耐盐的转基因植物的制备方法，其特征在于包括下述步骤：（1）获得玉米转录因子基因ZmPIF3核苷酸序列及氨基酸序列；（2）用RT-PCR获得玉米ZmPIF3基因片段；（3）用荧光定量PCR的方法分析玉米转录因子基因ZmPIF3在逆境胁迫时的表达谱，将ZmPIF3基因片段构建到质粒载体中；（4）利用电击法将步骤(3)得到的带有ZmPIF3的质粒转化农杆菌；（5）将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物；（6）目标植...

【专利技术属性】
技术研发人员：高勇，陈建民，江薇，戴毅，陆怡，吴美琴，任晓芸，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32