本发明专利技术公开了一种能够提高番茄果实营养品质的猕猴桃基因及其应用方法，特征是该猕猴桃基因具有序列表SEQ ID NO.1的DNA序列；将其克隆至真核表达载体，获得含有猕猴桃基因序列SEQ ID NO.1的质粒；将该质粒转化农杆菌，将转化的农杆菌用于侵染番茄愈伤组织，获得能够提高番茄果实中糖分、色素含量的转基因植株。采用本发明专利技术的转基因番茄果实与野生型番茄果实相比，番茄果实的糖分，番茄红素，beta-胡萝卜素，叶绿素的含量能够得到明显提高。本发明专利技术所获得的基因SEQ ID NO.1在研究调控果实色素的积累过程和改良果实营养品质方面具有着重要理论意义和实际立用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种能够提高番茄果实营养品质的猕猴桃基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及与猕猴桃果实营养品质有关的基因序列，含该基因的真核表达重组质粒及所构建的真核表达载体在番茄果实营养品质改良中的应用方法。
技术介绍
果实中的色素含量是影响外部观感的重要因素，糖分、类胡萝卜素、维生素、矿物质含量等决定了果实的营养价值。目前，常采用三种方式来提高果实中色素含量，改善果实营养品质。第一种方式是转化色素合成途经中的结构基因，例如美国《代谢工程》杂志(Metabolic Engineering.2013,17:59-67)介绍了将番爺中转入雨生红球藻β-类胡萝卜素酮化酶和羟化酶，所获得的转基因番茄能够表达虾青素。表达外源结构基因来改良植物营养品质是目前植物工程领域应用最多的技术手段。第二种方式是改变光信号途经中某些基因的表达量可以增加果实中色素的含量。例如《美国科学院院刊》(Proc Natl Acad SciU S Α，2004，101 =9897-902)介绍，利用RNA干涉技术(RNAi)技术组成型地干涉番茄光形态建成的正调控基因(LeHY5)的表达，使番茄果实的类胡萝卜素含量和叶片中的叶绿素的含量下降，而番茄光形态建成的负调控基因(LeCOPlLIKE)的RNAi转基因番茄，果实中类胡萝卜素的总含量明显提高，叶片呈现深绿色。据英国《植物学报》(Plant Journal，2008，55,89-103)介绍，番茄中存在一类单基因的高色素突变体high pigment-1 (hpl)和highpigment-2 (hp2)，这类突变体的成熟果实积累的类胡萝卜素总量可以达到野生型的三倍，叶片和未成熟的绿果实中叶绿素的含量也比野生型的高。研究发现这类突变体可能影响红光远红光受体(phytochrome)和蓝光受体(crytochrome)下游的信号转导。第三种方式是改变某些与叶绿体发育有关转录因子的表达，也能够显著的影响果实的品质。如英国《植物学报》(Plant Journal, 2002, 31:713-727)介绍，转录因子Golden-like (GLK)在多个物种中调控叶绿体发育，如在拟南芥中AtGLKl或AtGLK2任何一个突变不会影响叶片中叶绿体的发育，但AtGLK2会使种子荚颜色变为淡绿色，AtGLKl和AtGLK2的双突变，会使得拟南芥叶片中的发育受到影响。GLKs除与叶片中叶绿体发生有关外，GLKs还与果实中叶绿体的发育有关。美国《科学》杂志(Science，2012，336:1711-1715)报道了在番茄中存在两种与叶绿体发育有关的基因，SlGLKl和S1GLK2，这2个基因在叶片中均表达，但仅S1GLK2在番茄果实中表达。在番茄中分别过表达AtGLKs (AtGLKl或AtGLK2)和S1GLK2均能使番茄色素和糖分含量显著增加，相反若基因S1GLK2突变会导致着果颜色较浅，成熟后颜色均匀，但糖分，类胡萝卜素等含量降低。商业培育者利用该基因的突变筛选出颜色均一，卖相好看，但营养品质欠佳的番茄果实。《自然-通讯》(Nat.Commun.2013,4:2640)介绍了本专利技术人课题组前期对红阳猕猴桃进行全基因组测序，组装出了全长为616.1Mb，包含39，040个基因的基因组。通过进一步的生物信息学分析，发现了一个与猕猴桃营养品质有关的转录调控基因。通过RT-PCR和克隆技术，从猕猴cDNA中获得了该基因，将该基因克隆至二元表达载体，二元载体转化农杆菌，转化的农杆菌侵染番茄愈伤组织，愈伤组织再生获得的转基因番茄果实具有较高的色素含量和糖分含量。尽管基因组数据库(http://bioinf0.bt1.cornel 1.edu/cg1-bin/kiwi/home.cgi)公开了登录号为Achn385381的猕猴桃EST序列，通过生物信息分析，该EST序列可能与果实营养品质有关，但该序列并不完整，而且还未经过生物学功能验证。另外，尽管已有许多研究利用外源基因遗传转化番茄提高番茄果实品质和色素含量，但之前尚未见到有发现影响猕猴桃营养品质的基因以及该基因在改造果实品质方面的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够提高番茄果实中糖分和色素含量的猕猴桃基因序列，包含该序列的真核重组质粒，以及利用该基因和真核重组质粒提高番茄色素和营养品质以获得含有高糖分、高类胡萝卜素含量的番茄品种的方法。本专利技术的能够提高番茄果实中糖分、色素含量的猕猴桃基因，是根据对猕猴桃全基因组测序结果，利用生物信息学方法进行注释分析得到一个与果实营养品质有关的EST序列，该序列在猕猴桃数据库中的登录号为Achn385381，其特征在于:根据Achn385381序列设计探针并进行同位素标记，同时提取猕猴桃果实RNA，进行反转录，构建cDNA文库，探针与文库进行杂交，挑取阳性克隆并测序，获得的如序列表所示的猕猴桃基因序列SEQ IDN0.1。本专利技术的能够提高番茄果实中糖分、色素含量的重组质粒，其特征在于:根据序列SEQ ID N0.1设计正向引物和反向引物；分别用所述正向引物和反向引物扩增猕猴桃基因序列SEQ ID N0.1，用连接酶连接扩增的PCR产物以及真核表达载体，连接产物转化大肠杆菌，获得转化克隆；所述真核表达载体可选用PBI121、pHB、pM0N1772、pBE12、pBC7或pBA。本专利技术的能够提高番茄果实中糖分、色素含量的基因和真核重组质粒的应用方法，其特征在于:将含猕猴桃基因序列SEQ ID N0.1的真核表达载体转化农杆菌，同时将野生型番茄种子进行浸泡溶胀，用次氯酸钠溶液消毒，然后无菌水清洗，将清洗后的种子放入1/2MS培养基上进行发苗，待子叶发出、真叶长出之前，剪取叶片，置于预培养基上进行培养至产生愈伤，然后将含有猕猴桃基因序列SEQ ID N0.1的真核表达载体转化的农杆菌侵染预培养番茄叶片，侵染时间5-20分钟，吸干叶片上的菌液，置于共培养基上培养2-4天，然后将叶片转移至再生培养基上，每20-30天更换再生培养基一次直至幼苗出现，然后将幼苗转移至生根培养基上获得转基因植株。原公开的猕猴桃EST序列Achn385381仅有420bp，而本专利技术获得的核酸序列SEQID N0.1长度为1194个核苷酸，经预测本专利技术序列含有完整的阅读框；由基因SEQ N0.1预测的如后面序列表中所示的氨基酸序列SEQ ID N0.2，氨基酸长度为397个氨基酸残基。 将本专利技术获得的上述含猕猴桃基因序列SEQ ID N0.1克隆至真核表达载体，获得含有猕猴桃基因序列SEQ ID N0.1的质粒，并将该质粒转化农杆菌，将转化的农杆菌用于侵染番茄愈伤组织，获得能够提高番茄果实中糖分、色素含量的转基因植株。将采用本专利技术的转基因番茄果实与野生型番茄果实相比，番茄果实的糖分，番茄红素，beta-胡萝卜素，叶绿素的含量能够获得明显提高。结果显示，本专利技术所述基因和真核重组载体能够提高果实的营养品质。本专利技术通过基因工程技术克隆获得的基因，在研究调控果实色素的积累过程和改良果实营养品质方面，具有着重要理论意义和实际应用价值。【附图说明】图1为PCR扩增探针杂交阳性克隆所获得的目的基因片段。图2为采用本专利技术的植物过表达载本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够提高番茄果实中糖分、色素含量的猕猴桃基因，其特征在于基因序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种能够提高番茄果实中糖分、色素含量的猕猴桃基因，其特征在于基因序列为SEQID N0.1 所示。2.一种能够提高番茄果实中糖分、色素含量的重组表达质粒，其特征在于含有权利要求I所述的序列SEQ IDN0.1。3.—种能...
【专利技术属性】
技术研发人员：李光伟，牛向丽，周昂，陈丹阳，刘永胜，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。