可稳定自发光的细菌质粒及其制备方法技术

一种可稳定自发光的细菌质粒及其制备方法，其包含luxABCDE自发发光基因、可启动luxABCDE自发发光基因的启动子、ColE1复制子、对氨比西林与卡那霉素的抗性基因、稳定质粒的相关基因以及接合生殖作用相关的基因，使本发明专利技术可容易地以接合传递进入细菌中表现发光基因蛋白质，又可稳定且大量地存在细菌中，不需额外填加发光受质以及筛选抗生素仍可持续且高效能地发光，方便于活体动物中直接观察细菌的动态变化；本发明专利技术制备步骤如下a.获得一可启动发光基因的质粒；b.将含ColE1复制子及抗性基因的质粒接入质粒pSE34中；c.结合步骤a.与b.质粒制得本发明专利技术的质粒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一种可用于标定细菌的发光质粒及其制备方法，尤指技术上提供一种在细菌世代繁殖中可稳定且大量存在于细菌中的革兰阴性细菌的自发发光载体及其制备方法。
技术介绍
一般欲得知细菌在动物体中的分布和行为，大多是在实验动物牺牲后，才能分析动物器官标本，而不能直接观察。于是遂有人研发利用发光基因在细菌中表现的方法，来观察细菌在动物体中的分布和行为，而利用发光基因在细菌中表现的方法，一般来讲有三种主要途径1.在质粒中直接表现发光基因，但受限于质粒本身的不稳定性，以致大部份的细菌容易遗失所植入的质粒，无法稳定且大量的存在细菌中，而在细菌的繁殖中，质粒难以稳定的存在于各个子细菌，往往只能维持少数几代而已，因此整体细菌表现的强度很快即转弱。若使用抗生素筛选，强迫细菌保有该质粒，否则无法存活，但此法却无法运用于活体动物中，因为如果给动物喂食抗生素，则由抗生素对测试动物所引起的变因将可能复杂化实验结果。2.将发光基因藉由转位子(transposon)逢机地插入细菌的染色体中，但不能确定被插入的DNA处是否为重要的基因所在；又因转位发生机率不高，更增填筛选上的困难度。况且此法只针对该种已转位的菌株，若应用于其它种菌株则其转位子的位置将会不同， 如此将更增填变因，以致不能作多种菌株的观察和比较。3.以双重组交换将发光基因插入细菌的染色体中，虽然可以准确地插入特定基因中，但其发生机率不高，又因发光基因(IuxAB⑶E-kan)本身很长(至少71Λ)，更降低重组交换的机率，难以完成大分子DNA在细菌中的克隆及传递。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种，欲解决的技术问题点是一般欲得知细菌在动物体中的分布和行为，大多需牺牲动物才能分析动物器官标本，而一般利用发光基因在细菌中表现的方法，有以下几点缺失1.若在质粒中直接表现发光基因，受限于质粒本身的不稳定性，大部份的细菌容易遗失所植入的质粒，无法稳定且大量的存在细菌中；2.若发光基因藉由转位子(transposon)逢机地插入细菌的染色体，不能确定被插入DNA处是否为重要的基因所在，且转位发生机率不高；另外也只受限于该转位的测试菌株可被使用而已，却不能广泛地应用于其它多种菌株上；3.若以双重组交换将发光基因插入细菌的染色体中，其发生机率不高，且发光基因本身很长不容易完成在细菌中的克隆及传递。解决问题的技术特点一种可稳定自发光的细菌质粒，其包含luxABCDE自发发光基因、可启动luxABCDE自发发光基因的启动子、ColEl复制子、对氨比西林与卡那霉素的抗性基因、pir、parG、parF、stbD、及StbE稳定质粒的相关基因，以及pilXl至pilXll与taxA、taXB、taXC接合生殖作用相关的基因；本专利技术的质粒制备步骤如下a.获得一可启动发光基因(luxABCDE)的质粒；b.将含ColEl复制子及抗性基因的质粒接入质粒pSE34中；c.结合步骤a.与b.质粒制得本专利技术的质粒。对照先前技术的功效本专利技术的革兰阴性细菌专用的稳定自发发光载体有以下几点功效第一，可直接使用此发光质粒于细菌中，有利于观察其在动物体内的分布变化。因而无需牺牲动物，即可直接分析研究细菌在动物体内的分布和行为。第二，本专利技术的发光质粒可稳定存在于细菌中，并可大量复制质粒，如此有助于细菌的发光强度，能持续而且能高效地表现，因而能克服质粒在细菌的繁殖中，难以稳定且大量的存在细菌中的缺点。第三，本专利技术可利用质粒的接合生殖作用，既可帮助克隆(cloning)又可便于该质粒在细菌与细菌的间传递本专利技术的发光质粒。如此即可简单的选出所需要的高效能且持续发光的细菌，而可减少许多在克隆(cloning)时筛选工作的负担，尤其本专利技术因含有许多重要功能的基因以致质粒DNA过大，所以当在一般DNA克隆(cloning)的剪接上，成功机率相对上很低。因此，利用接合生殖作用可降低克隆上的困难度。附图说明图1 本专利技术其一实施例的步骤流程图。图2A 本专利技术其一实施例的质粒pXen-5架构图。图2B 本专利技术其一实施例构筑质粒p3ZLux4示意图。图3A 本专利技术其一实施例的质粒PSE34架构图。图;3B 本专利技术其一实施例构筑质粒pSE-Luxl示意图。图4 为本专利技术其一实施例的质粒pSE-Luxl架构图。具体实施例方式本专利技术的可稳定自发光的细菌质粒pSE_Luxl(SEQ ID NO 1)，含有至少一 IuxAB⑶E自发发光基因(SEQ ID NO 21)、至少一可启动IuxAB⑶E自发发光基因的启动子、 至少一可大量复制的ColEl复制子、至少一抗性基因、至少一pir基因(SEQ ID NO 3)、至少一 parG 基因(SEQ ID NO 4)、至少一 parF 基因(SEQ ID N05)、至少一 stbD 基因(SEQ ID NO 6)与至少一 StbE基因(SEQ ID NO 7)，以及包含至少一 pilXl基因(SEQ ID NO 8)、至少一 pilX2 基因(SEQ ID NO 9)、至少一 pilX4 基因(SEQ ID NO 10)、至少一 pilX5 基因 (SEQ ID NO 11)、至少一 pi 1X6 基因(SEQ ID NO 12)、至少一 pi 1X7 基因(SEQ ID NO 13)、 至少一pilX8基因(SEQID NO 14)、至少一pilX9基因(SEQ ID NO 15)、至少一pilXlO基因 (SEQ ID NO 16)、至少一 pi 1X11 基因(SEQ ID NO 17)、至少一 taxA 基因(SEQ ID NO 18)、 至少一 taxB 基因(SEQ ID NO 19)与至少一 taxC 基因(SEQ ID NO 20)。其中，该可启动IuxAB⑶E自发发光基因的启动子为Plaez启动子(SEQ ID N022)。其中，该抗性基因可为对氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因或对卡那霉素 (kanamycin,Kan)的抗性基因，或含有对氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因加上对卡那霉素(kanamycin，Kan)的抗性基因两种抗性基因。其中，该pir、parG、parF、stbD与stbE为稳定质粒的相关基因；该pilXl、pilX2、 pilX4、pilX5、pilX6、pilX7、pilX8、pilX9、pilXlO、pilXll、taxA、taxB 与 taxC 基因为接合生殖相关的基因，有助于质粒的接合生殖作用，帮助质粒的克隆以及在细菌与其他菌种细菌间的传递(如将质粒从沙门氏菌传递至大肠杆菌)。其中，IuxAB⑶E自发发光基因既含有发光酶IuxAB基因又有脂肪酸还原酶Iux⑶E 基因，即可合成脂肪醛，直接供发光酶于发光时所需的受质，因此无需额外受质(如脂肪醛类)的填加。本专利技术的质粒pSE-Luxl可表现自发发光基因蛋白质，又可非常稳定的存在细菌中持续发光，在细菌世代繁殖中可稳定且大量存在于细菌中，更有利于活体动物内直接观察。本专利技术的可稳定自发光的细菌质粒制备步骤如下(a)、将缺乏启动子的发光基因(luxABCDE)接入一含启动子的质粒中，使发光基因(luxABCDE)可利用启动子来启动转录。(b)、将含至少一 ColEl复制子及至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种可稳定自发光的细菌质粒，其包含至少一ｌｕｘＡＢＣＤＥ自发发光基因、至少一可启动ｌｕｘＡＢＣＤＥ自发发光基因的启动子、至少一ＣｏｌＥ１复制子、至少一抗性基因、至少一ｐｉｒ基因、至少一ｐａｒＧ基因、至少一ｐａｒＦ基因、至少一ｓｔｂＤ基因与至少一ｓｔｂＥ基因，以及包含至少一ｐｉｌＸ１基因、至少一ｐｉｌＸ２基因、至少一ｐｉｌＸ４基因、至少一ｐｉｌＸ５基因、至少一ｐｉｌＸ６基因、至少一ｐｉｌＸ７基因、至少一ｐｉｌＸ８基因、至少一ｐｉｌＸ９基因、至少一ｐｉｌＸ１０基因、至少一ｐｉｌＸ１１基因、至少一ｔａｘＡ基因、至少一ｔａｘＢ基因与至少一ｔａｘＣ基因。

【技术特征摘要】
1.一种可稳定自发光的细菌质粒，其包含至少一 IuxAB⑶E自发发光基因、至少一可启动IuxAB⑶E自发发光基因的启动子、至少一 ColEl复制子、至少一抗性基因、至少一 pir基因、至少一 ParG基因、至少一 parF基因、至少一 StbD基因与至少一 StbE基因，以及包含至少一 pilXl基因、至少一 pilX2基因、至少一 pilX4基因、至少一 pil)(5基因、至少一 pil)(6 基因、至少一 pilX7基因、至少一 pilX8基因、至少一 pilX9基因、至少一 pilXlO基因、至少一 pilXll基因、至少一 taxA基因、至少一 taxB基因与至少一 taxC基因。2.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该可启动luxABCDE自发发光基因的启动子为Pla。z启动子。3.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该抗性基因包含对氨比西林(ampicillin)的抗性基因。4.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该抗性基因包含对卡那霉素(kanamycin)的抗性基因。5.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该抗性基因包含对氨比西林(ampicillin)的抗性基因与对卡那霉素(kanamycin)的抗性基因。6.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该可稳定自发光的细菌质粒为如SEQ ID NO :1所述的核甘酸序列。7.一种制备可稳定自发光的细菌质粒的方法，包含下列步骤(a)、将缺乏启动子的发光基因(luxABCDE)接入一含启动子的质粒中，使发光基因 (luxABCDE)可利用启动子来启动转录。(b)、将...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱政洵，陈奇良，黄耀广，
申请(专利权)人：长庚医疗财团法人林口长庚纪念医院，
类型：发明
国别省市：71