本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法及应用，以荻成熟种子为外植体，诱导愈伤组织，通过农杆菌介导的遗传转化方法，利用hptII基因作为筛选基因，以潮霉素作为选择剂，对转化后的愈伤组织在相应的筛选压力培养基上进行两次筛选，分化出的植株经PCR检测，证实外源基因已整合到荻基因组中，获得了转基因荻植株。本发明专利技术首次报道了采用农杆菌介导荻种子愈伤转化的方法。本发明专利技术为荻遗传转化创新种质资源提供了新的技术平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物转基因
，具体涉及一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转 化方法。
技术介绍
荻（Miscanthus saccharif lorus (Maxim) Benth.)为禾本科多年生水陆两生的草 本植物。荻高1~1. 5m，直径约5mm，具有10多个节和发达被鳞片的长匍匐根状茎，原产于 东亚，目前在我国东北、华北、西北和华东地区均有分布。因具有再生能力强、适应性强和干 物质产量高等特点，被认为是一种重要的能源植物。而利用能源植物开展重金属污染土壤 修复可以实现生物质原料生产与污染土壤治理的双赢。例如，公开号为CN101786097A的中国专利技术专利申请文献公开了一种修复镉铅等 重金属污染土壤的方法，技术方案是：在含污染物镉铅等金属的土壤上种植荻，当荻长到成 熟期后，将荻整体从污染土壤上移走；在含污染物镉铅等重金属的土壤上种植荻，采用露天 常规栽培，调节土壤水份和营养成分。然而，荻对于土壤修复还存在一定的局限性，例如，虽然荻对重金属具有较强的耐 性，但由于其不能把较多的重金属转移到地上部，而不能有效的用于植物修复。建立荻转基 因技术是一种很好的快速培育荻抗逆新品种的方法。例如，公开号为CN 102239808A的中 国专利技术专利申请文献公开了荻的组织培养基及组培方法，组培方法经过如下五个步骤：一 是外植体的采集与消毒，二是初代培养，三是不定芽诱导，四是不定芽增殖培养，五是生根 诱导。并公开了分别用于初代培养、不定芽诱导、不定芽增值培养基生根诱导的4中培养 基。由于转化方法成熟、转化效率高和操作简单等优点，农杆菌转化法已成为应用最 广泛的植物转化方法。然而，截止到目前，还没有关于采用农杆菌介导荻愈伤组织转基因技 术的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了，为通过转基因 技术培育荻抗逆新品种奠定了基础。 -种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，包括如下步骤： (1)选取荻成熟种子，消毒、清洗后依次进行愈伤组织诱导、继代培养； (2)将继代培养后的胚性愈伤组织置于含有农杆菌菌液的侵染液中侵染，所述农 杆菌菌液带有表达载体；侵染后的胚性愈伤组织在共培养基上进行共培养； (3)取共培养后的愈伤组织依次经无菌水和含羧卞青霉素的无菌水清洗，然后移 至含有羧卞青霉素和潮霉素的选择培养基上进行筛选； (4)将筛选得到的抗性愈伤组织移至分化培养基上，进行分化培养，诱导出不定 芽； (5)将分化出的不定芽移至生根培养基上，培养成完整植株。 荻成熟种子的消毒、清洗过程为：选取籽粒饱满的荻种子，依次用75%的乙醇和 30%的次氯酸钠消毒，消毒结束后用无菌水清洗种子。 愈伤组织诱导过程为：将消毒的种子在无菌滤纸上晾干，接种到诱导培养基上，每 皿20颗左右，用封口膜封好培养皿，在28°C光照培养箱培养40天。 继代培养过程为：用镊子挑选生长良好的胚性愈伤组织接种于继代培养基上，在 28°C光照培养箱继代培养15天。 愈伤组织诱导和继代培养基：MS培养基+6mg/L 2, 4-D+O. lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤 +0? 5g/L水解酪蛋白+0? 5g/L脯氨酸；鹿糖30g/L ;Phytagel植物凝胶4g/L ;pH 5. 8。 优选地，所述农杆菌为EHA105;所述表达载体为pCAMBIA1300。pCAMBIA1300的物 理图谱如图1所示，该表达载体为空载体，载体上含有35S启动子序列和hptll基因序列。 进一步地，步骤（2)中所述含农杆菌菌液的侵染液由如下方法制备： 挑取单个携带PCAMBIA1300载体的农杆菌菌落，接入到含有卡那霉素和链霉素的 YEP液体培养基中，26~30°C过夜培养，得到0D600为0. 8-1. 0的菌液；取培养好的菌液 离心收集菌体，用含乙酰丁香酮的侵染液重悬菌体，使重悬后的菌液0D600达到0. 015~ 0. 025,即得所述含农杆菌菌液的侵染液。 更进一步，挑取单个携带PCAMBIA1300载体的农杆菌菌落，接入到含有50mg/L卡 那霉素和50mg/L链霉素的YEP液体培养基中，28°C过夜培养，得到0D600为0. 8-1. 0的菌 液；取培养好的菌液lml离心收集菌液，用含200 y M乙酰丁香酮的侵染液重悬菌液，使重悬 后的菌液0D600达到0.02,即得步骤（2)中所述含农杆菌菌液的侵染液。 其中，含200 y M乙酰丁香酮的侵染液的组成为：MS培养基+lmg/L烟酸+lmg/L盐 酸吡哆醇+l〇mg/L盐酸硫脘素+0. lg/L肌醇+3. 9g/L 2- (N-吗啡啉）乙磺酸+0. 5g/L水解 酪蛋白；蔗糖30g/L ;pH 5. 5;高压灭菌冷却至55°C时加入乙酰丁香酮至终浓度为200 yM。 YEP液体培养基：10g/L酵母提取物+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠。 优选地，步骤（2)中在侵染液中侵染的时间为5-10min。 步骤（2)中共侵染时的振荡速度为80rpm。 优选地，共培养培养基为：MS培养基+lmg/L烟酸+lmg/L盐酸吡哆醇+10mg/L盐 酸硫脘素+〇. lg/L肌醇+3. 9g/L 2-(N-吗啡啉）乙磺酸+0. 5g/L水解酪蛋白；蔗糖30g/ L ;Phytagel植物凝胶4g/L ;pH 5. 8 ;高压灭菌冷却至55°C时加入乙酰丁香酮至终浓度为 200 y M〇 共培养时的培养条件为：将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；将 愈伤组织置于有一张无菌滤纸的共培养基上，24~26 °C (优选25 °C )暗培养2~4 (优选 3)天。 优选地，步骤（3)中在利用选择培养基进行两轮筛选。 进一步优选地，选择培养基：MS培养基+6mg/L 2, 4-D+O. lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤 +0? 5g/L水解酪蛋白+0? 5g/L脯氨酸；鹿糖30g/L ;Phytagel植物凝胶4g/L ;pH 5. 8 ;第一 轮筛选的选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和80mg/L潮霉素；第二轮筛选 的选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和100mg/L潮霉素。 更进一步优选地，每轮筛选的周期为20天。 选择培养前先用无菌水清洗5-6次，再用含300mg/L的羧卞青霉素的无菌水清洗 2遍；然后在无菌滤纸上晾干。 优选地，分化培养条件：将选择培养后的抗性愈伤移至分化培养基上，放入恒温 (25±1°C )培养室中，光照时间16小时，光照强度为12001x，相对湿度为60±2%，培养40 天后可诱导出不定芽。 分化培养基：MS培养基+0? 5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0? 05mg/L萘乙酸；蔗糖30g/ L ;Phytagel植物凝胶4g/L ;pH 5. 8。 优选地，生根培养条件：将分化出来的不定芽分成的单株接种到生根培养基上，放 入恒温（25±1°C )培养室中，光照时间16小时，光照强度为12001x，相对湿度为60±2%， 10天后形成完整植株。 生根培养基：1/2MS培养基+0? 4mg/L萘乙酸；蔗糖30g/L ;Phytagel植物凝胶4g/ L ；pH 5. 8〇 对获得的完整植株进行阳性苗PCR检测：将获得的所得的转35S启动子和hpt基 因的植株进行PCR检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选取荻成熟种子，消毒、清洗后依次进行愈伤组织诱导、继代培养；(2)将继代培养后的胚性愈伤组织置于含有农杆菌菌液的侵染液中侵染，所述农杆菌菌液带有表达载体；侵染后的胚性愈伤组织在共培养基上进行共培养；(3)取共培养后的愈伤组织依次经无菌水和含羧卞青霉素的无菌水清洗，然后移至含有羧卞青霉素和潮霉素的选择培养基上进行筛选；(4)将筛选得到的抗性愈伤组织移至分化培养基上，进行分化培养，诱导出不定芽；(5)将分化出的不定芽移至生根培养基上，培养成完整植株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭海朋，蒋德安，洪春桃，郑炳松，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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