本发明专利技术属于分子生物学和生物技术领域，公开了农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法。本方法是在遗传转化时用无菌棉棒蘸取农杆菌涂抹于大豆子叶节部位进行接种，共培养３ｄ后ＧＵＳ染色率可高达９３．１８％，与传统的大豆子叶节遗传转化方法相比大大提高了农杆菌的转化效率，为进一步开展农杆菌介导的大豆转基因构建一个强有力的技术平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和生物
，涉及。
技术介绍
1984年，大豆的遗传转化研究首次被报道，并且证明农杆菌介导的不同作物之 间的DNA转化是可靠而高效的。1988年，Hinchee等从100多份材料中筛选出对农杆菌 敏感的大豆品种，以其子叶为受体材料，首次获得了大豆转基因植株(参考文献=Hinchee M AW, Connor-Ward DV, Newell C A, McDonnell R Ε, Sato S J, Gasser C S, FischhoffD A, Re D B, Fraley R Τ, Horsch RB. Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer· Biotechnology，1988，6 :915_922)。 i亥石if胃； 证明了农杆菌可以介导大豆的遗传转化，这是遗传工程应用于大豆改良上的一个里程碑。 已报导的大豆遗传转化体系包括农杆菌介导法、花粉管通法、基因枪及PEG法等。农杆菌介 导的转基因方法操作简便，成本低，是目前应用最广泛的一种方法。它是以大豆的子叶、子 叶节、胚轴为外植体，通过抗生素筛选，器官发生再生转化植株。其中以子叶节为外植体的 转化体系，即大豆子叶节转化体系由于具有组织培养时间较短，不易产生体细胞突变体和 不育的植株；培育出的转基因植株具有较少的外源基因拷贝，遗传行为上较为简单稳定等 优点，运用更为普遍。长期以来，在以植物组织培养为基础的基因转化过程中，由于受基因型限制，以及 受体系统不完善、大豆对农杆菌不敏感等原因，使转化的最佳条件难以确定，使农杆菌介导 的大豆遗传转化频率低，实验结果重复性差。大豆一直被公认为难转化的作物之一，严重 制约着基因工程技术在大豆遗传改良中的应用。在过去的几十年里，大豆的转化研究工作 主要集中在通过利用GUS等报告基因优化转化方法，建立高效率的大豆遗传转化及再生体 系，但结果都不十分理想，仍存在遗传转化率较低的问题，如刘栋等选用‘科丰6号’和‘合 丰35’得到的⑶S瞬时表达率分别为52. 2%和54. 5% (参考文献刘栋，石强，李鹏丽，王 宁宁.利用GUS基因瞬时表达对大豆子叶节和胚尖转化方法的比较及优化.生物学通报， 2008,43(12) :35-39)。李文霞等对农杆菌介导的大豆子叶节转化系统优化的研究中发现 ‘黑农35’子叶节区GUS阳性率最高，为63. 3% (参考文献李文霞，宁海龙，吕文河，李文 滨.农杆菌介导的大豆子叶节转化系统优化.中国农业科学，2008，41 (4) :971-977)，而本 专利技术所使用的涂抹法，GUS染色率可高达93. 18%，与传统的大豆子叶节遗传转化方法相比 大大提高了农杆菌的转化效率。
技术实现思路
本专利技术为解决农杆菌遗传转化大豆子叶节转化率低的问题，提供一种新型、高效 的，大大简化了遗传转化步骤。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现，包括大豆子叶节的外植体的获得、农杆菌的 活化、遗传转化、共培养步骤，所述的农杆菌含有携带报告基因和/或外源基因的质粒，所 述的遗传转化是用无菌棉棒蘸取经活化的所述的农杆菌涂抹于所述的外植体子叶节部位。所述的含子叶节的外植体通过如下方法获得取发育饱满无病害的大豆种子，消 毒后将种子在无菌水中浸泡30 60min后接种于B5培养基，培养5_7d，获得无菌苗；取子 叶未完全展开的无菌苗，剥去种皮，切去根和大部分下胚轴，保留3-5mm的下胚轴，沿种子 中线切开，分离两片子叶，切除顶芽及初生芽。所述的大豆种子消毒方法为取发育饱满无病害的大豆种子，70%乙醇浸泡30s表 面消毒，无菌水冲洗2次；0. 升汞消毒lOmin，无菌水冲洗5 6次，每次4 5min。所述的共培养是将遗传转化步骤获得的涂抹了农杆菌的外植体插入共培养培养 基，黑暗中共培养3-3. 5d。所述的共培养培养基组成为B5基本培养基+ImM硫代硫酸钠+ImM半胱氨酸+3% 蔗糖 +ImM 二硫苏糖醇 +200 μ mol · Γ1 乙酰丁香酮 +1. 67mg · U^-M+O. 25mg · Γ1 赤霉素， ρΗ5. 4，+0. 7%琼脂。上述浓度均为各物质在共培养基中的终浓度。所述的农杆菌为LBA4404、EHAlOl 或 KYRTl，优选 LBA4404。所述的报告基因为⑶S基因。本专利技术的转化效率可通过如下方法检测共培 养后将外植体用蒸馏水冲洗，按照Jefferson的方法进行GUS组织化学染色。切下外植体 的子叶节部位，浸泡在X-gluc溶液中，37°C温育过夜，95%乙醇脱色，检测显色反应。瞬时⑶S表达率=⑶S基因瞬时表达外植体数/总外植体数X 100%。有益效果本专利技术提供一种高效，该方法简单方便，大大 简化了遗传转化步骤，可以快速完成遗传转化，并且极大提高了转化效率，优化了农杆菌介 导大豆子叶节遗传转化体系，为进一步开展农杆菌介导的大豆转基因研究构建一个强有力 的技术平台。附图说明图1共培养3d后⑶S染色情况。A、C为对照传统菌液遗传转化外植体的染色结果，图C为图A中个体的放大图；B、D为涂抹法遗传转化外植体的染色结果，图D为图B中个体的放大图。具体实施例方式实施例11.1外植体的制备选用‘辽鲜’ (Glycine max (L)Merrill ；购自南京理想种苗有限公司)作为试验材 料。取发育饱满无病害的种子，70%乙醇浸泡30s表面消毒，无菌水冲洗2次后用0. 升 汞消毒lOmin，无菌水冲洗5 6次，每次4 5min。随后将种子浸泡于无菌水中45min后 接种于 B5 培养基(主要成分为大量元素KN032. 5g -Γ1, (NH4)2SO4O. 134g -T1jCaCl2 ·2Η20 0. 15g · ΙΛ MgSO4 · 7H20 0. 025g · Λ KH2PO4 · 2H20 0. 15g · Γ1 ；微量元素:KI 0. 75mg · ΛH3BO3 3. Omg .LlMnSO4 ·4Η20 IOmg 'T1jZnSO4 ·7Η20 2. Omg .Γ1，Na2MoO4 ·2Η20 0· 25mg .Γ1， CuSO4 · 5Η20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6Η20 0. 025mg · Γ1 ；有机成分烟酸 1· Omg · Γ1，肌醇 IOOmg · ΙΛ 盐酸硫胺素 IOmg · Λ 盐酸吡哆辛 1. Omg · Γ1 ；铁盐=FeSO4 · 7Η20 27. 8mg · Λ Na2EDTA · 7Η20 37. 3mg · L-1)，转入光照培养箱。培养条件为25°C，培养5_7d (光周期为光 照16h，黑暗8h)，获得无菌苗。无菌苗取子叶还未完全展开的无菌苗，剥去种皮，切去根和大部分的下胚轴，保留 3-5mm的下胚轴，沿种子中线切开，分离两片子叶，切除顶芽及初生芽，即得含子叶节的外植 体。1. 2农杆菌的制备与活化1.2. 1质粒转化农杆菌(1)-70°C冰箱中取出一支冻存的感受态农杆菌LBA4404(北京鼎国昌盛生物技术 有限责任公司)置于冰上融化；(2)取10 μ 1 PCAMMBIA3301本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱月林，盖钧镒，王华，杨立飞，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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