土壤杆菌及使用土壤杆菌的转化植物的制造方法技术

本发明专利技术的课题在于提供一种提高了基因靶向效率的土壤杆菌。根据本发明专利技术可以提供一种具有与野生型同等的T‑DNA核转移能力，且与野生型相比，丧失或降低了T‑DNA染色体插入能力的土壤杆菌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及提高了基因靶向效率的土壤杆菌及使用该土壤杆菌的转化植物的制造方法。
技术介绍
对于目前普及的植物转化技术(非专利文献1)而言，无法将目的基因插入染色体上的目标部位，不仅目的基因随机地插入染色体，而且无法控制导入的目的基因的拷贝数。由此，对于目前的转化技术而言，存在如下问题：例如，由外来基因的插入部位导致的基因表达水平不一致而产生所谓的“位置效果”(非专利文献2)、目的基因插入影响正常生长的染色体上的位置、多个目的基因的插入导致目的基因的失活。因此，对于目前的转化技术而言，需要在制备庞大数量的转化体后从其中选择仅在希望部位插入了目的基因的转化体，存在效率差的问题。为了解决该问题、制备安全且高功能的基因重组作物，要求开发能够在染色体上的指定位置导入希望拷贝数的目的基因的基因靶向技术。近年来，作为技术开发取得了进展的植物基因靶向技术，报告了利用人工核酸酶、染色质结构的改变或者同源重组相关因子等的方法(非专利文献3～5)。这些技术均是通过改变植物体而使同源重组效率提高的技术，需要对每一应用的植物种进行最优化，从这一点考虑，存在通用性低、且难以与其它技术组合使用的问题。另一方面，在使用土壤杆菌的植物转化中，作为与目的基因插入植物染色体上的位点相关的土壤杆菌的基因，已知Vir基因。专利文献1中记载了在植物中使蛋白质短暂性表达的方法，作为土壤杆菌，记载了使用野生型菌株(例如，根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)等)或者1个或多个基因突变而使转化效率增加的菌株(例如，包含多余virG基因拷贝，如优选与多拷贝质粒连接的源自pTiBo542的超级virG基因的土壤杆菌株，如由于突变体或嵌合体的virA基因或者virG基因的存在而引起改变了vir基因表达和/或其诱导的土壤杆菌株等)(段号0127)。专利文献2中记载了如下内容：包含第一种T-DNA的土壤杆菌株和包含第二种T-DNA的土壤杆菌株的用于植物细胞与上述两种T-DNA同时转化的用途，所述第一种T-DNA包含没有产生功能性virE2蛋白质的能力且含有可选择的标记基因，所述第二种T-DNA包含编码功能性virE2蛋白质的基因及希望的基因(权利要求10)。另外，专利文献3中记载了与野生型土壤杆菌、通过转染互补而成的突变体土壤杆菌相比，由缺失virE2的土壤杆菌引起的T-DNA传递效率约降低10,000倍(段号0069)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2013-534430号公报专利文献2：日本特表2011-505806号公报专利文献3：日本特表2008-505622号公报非专利文献非专利文献1：PitzschkeandHirt.Newinsightsintoanoldstory：Agrobacterium-inducedtumorformationinplantsbyplanttransformation.TheEMBOJournal(2010)29,1021-1032非专利文献2：MatzkeA.andMatzkeM.(1998)Positioneffectsandepigeneticsilencingofplanttransgenes、Curr.0pin.PlantBiol.1142-148.非专利文献3：Kumaretal.“GeneTargeting：DevelopmentofNovelSystemsforGenomeEngineeringinPlants”Floriculture,OrnamentalandPlantBiotechnologyVolumeIV(2006)GlobalScienceBooks非专利文献4：Shukla,etal.“PrecisegenomemodificationinthecropspeciesZeamaysusingzinc-fingernucleases.”Nature(2009)459437-441非专利文献5：Endo,etal.IncreasedfrequencyofhomologousrecombinationandT-DNAintegrationinArabidopsisCAF-1mutants,EMBOJ.25(2006)5579–5590.
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术的应解决课题在于实现通用性高且能够与其它植物转化技术组合使用的植物转化技术。更具体而言，本专利技术的应解决的课题为提供一种提高了基因靶向效率的土壤杆菌。进而本专利技术的应解决的课题为提供一种上述土壤杆菌的制造方法、使用上述土壤杆菌得到的植物细胞、以及使用了上述土壤杆菌的转化植物的制造方法。解决课题的方法本专利技术人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过使用与野生型具有同等的T-DNA核转移能力、且与野生型相比丧失或降低了T-DNA染色体插入能力的土壤杆菌进行植物的转化，能够显著增加基因靶向效率，从而完成了本专利技术。即，本专利技术包括以下内容。[1]一种土壤杆菌，其具有与野生型同等的T-DNA核转移能力，且与野生型相比，丧失或降低了T-DNA染色体插入能力。[2]根据[1]所述的土壤杆菌，其中，在对植物进行转化时，同源重组效率比野生型土壤杆菌提高了2倍以上(其中，同源重组效率是指发生了同源重组的个体数/供于转化的个体数)。[3]根据[1]或[2]所述的土壤杆菌，其中，在对植物进行转化时，基因靶向效率比野生型土壤杆菌提高了2倍以上(其中，基因靶向效率是指同源重组效率/随机重组效率。同源重组效率是指发生了同源重组的个体数/供于转化的个体数。随机重组效率是指发生了随机重组的个体数/供于转化的个体数。)。[4]根据[1]～[3]中任一项所述的土壤杆菌，其中，在对植物进行转化时，基因靶向效率为1％以上(其中，基因靶向效率是指同源重组效率/随机重组效率。同源重组效率是指发生了同源重组的个体数/供于转化的个体数。随机重组效率是指发生了随机重组的个体数/供于转化的个体数。)。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的土壤杆菌，其中，与T-DNA随机插入相关的基因的功能丧失或降低。[6]根据[5]所述的土壤杆菌，其中，与T-DNA随机插入相关的基因为选自ATU3081基因、ATU4309基因、ATU6150(virH1)基因、ATU6154(virF)基因、ATU6156(virK)基因、ATU6183(virD3)基因、ATU6184(virD4)基因、ATU6185(virD5)基因、ATU6188(virE0)基因、ATU6189(virE1)基因、ATU6191(virE3)基因、ATU6180(virC1)基因或它们的同源基因中1种以上的基因。[7]根据[1]～[6]中任一项所述的土壤杆菌，其是毛根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)或根癌土壤杆菌。[8]根据[1]～[7]中任一项所述的土壤杆菌，其具有包含外来基因的靶向载体。[9]一种土壤杆菌的制造方法，其是[1]～[8]中任一项所述的土壤杆菌的制造方法，该方法包括，通过同源重组法破坏土壤杆菌的染色体中与T-DNA随机插入相关的基因的工序。[10]一种植物细胞，其是通过使[8]中所述的土壤杆菌对植物细胞进行感染而得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种土壤杆菌，其具有与野生型同等的T‑DNA核转移能力，且与野生型相比，丧失或降低了T‑DNA染色体插入能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.16 JP 2014-1025661.一种土壤杆菌，其具有与野生型同等的T-DNA核转移能力，且与野生型相比，丧失或降低了T-DNA染色体插入能力。2.根据权利要求1所述的土壤杆菌，其中，在对植物进行转化时，同源重组效率比野生型土壤杆菌提高了2倍以上，所述同源重组效率是指发生了同源重组的个体数/供于转化的个体数。3.根据权利要求1或2所述的土壤杆菌，其中，在对植物进行转化时，基因靶向效率比野生型土壤杆菌提高了2倍以上，所述基因靶向效率是指同源重组效率/随机重组效率，所述同源重组效率是指发生了同源重组的个体数/供于转化的个体数，所述随机重组效率是指发生了随机重组的个体数/供于转化的个体数。4.根据权利要求1～3中任一项所述的土壤杆菌，其中，在对植物进行转化时，基因靶向效率为1％以上，所述基因靶向效率是指同源重组效率/随机重组效率，所述同源重组效率是指发生了同源重组的个体数/供于转化的个体数，所述随机重组效率是指发生了随机重组的个体数/供于转化的个体数。5.根据权利要求1～4中任一项所述的土壤杆菌，其中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：滨田晴康，柳乐洋三，田冈直明，今井亮三，小岛峰雄，三木隆二，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：日本;JP