利用致瘤土壤杆菌转化黄瓜和转化黄瓜植物的再生制造技术

一种把遗传物质转移和整合到黄瓜植物基因组中去的方法，此法利用源于子叶或下胚轴的外植体产生转化胚状体；一种从胚状体达到转化植物再生的方法。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
双子叶植物对两种革兰氏阴性土壤杆菌-土壤致瘤杆菌和土壤生根杆菌易感，分别导致根癌和毛根病(见综述BevanandChilton，1982，Ann.Rev.Genet.，16357-384)。引起任一此类疾病的致病菌已确定来源于大pTi或pRi质粒一个片断的转移和整合。此片断又通称为T-DNA区(Chiltonetal.，1977，Cell11∶263-271;chiltonetal;1982，Nature，295∶432-434)。对pTi和pRiT-DNA转移机理中几个共同步骤和对包含于引起此类疾病的这些T-DNA区中基因的确定已导致遗传工程制造无毒土壤杆菌株(Hepburnetal，1985，I.GeneralMicrobio.，131∶2961-2969;Hoodetal，1986，I·Bacteriology，168∶1291-1301;Vilaineandcasse-Delbart，1987，Mol.Gen.Genet.206∶17-23)。这个信息还引发了制备更小的、广宿主的、能在大肠杆菌和土壤杆菌中复制的质粒。此质粒含有土壤杆菌生成的pTi或pRiDNA信号。此信号为基因工程的T-DNA转移所必需。这些质粒也称为双栖性质粒。(Bevan1984，Nuel.Acids，Res.，12∶8711-8721;Anetal.，1985)已知许多种属于葫芦科的植物对这些致病性土壤杆菌易感(见综述，AndersonandMoore，1979，Phytopath，69∶320-323;Smarrellietal，1986，Plant.Physiol.，82∶622-624)。另外，也早已建立了使许多此类植物再生的程序(MalepszyandNadolsha-orczyk，1983，ZPflanzenphysiol.，111∶273-276Nadolska-orczykandMalepszy，1984，BulletinPol.Acad.Sci.，32∶423-428;Jelaska，1986，BiotechnologyinAgricultureandForestry(ed，byY.P.S.Bajai)2∶371-386)。综合这两个事实提示;使土壤杆菌介导的遗传信息转移到南瓜种植物基因组中应该是易于完成。建立一个把遗传物质转移和整整合到南瓜种基因组中的系统，将对那些很难或不可能用通常植物接种技术而达到的遗传性状的转移有用。适用于南瓜类基因转移的技术的建立，能用于转移那些可赋于抗病毒感染的基因工程所获得的基因(Powell-Ableetal，1986，Science，232∶738-743;Cuozzoetal，1988，Biol/tech，5∶549-557，herbicideresistartComaietal，1985，Nature，317∶741-744;della-Cioppaetal，1987，Bio/tech，5∶579-584;leeetal，1988，EMBOJ.，7∶1241-1248;Stalkeretal，1985，J.Biolchem260∶4724-4728)，或转移任何其他有用的性状;只要这些性状可利用。表达NPTⅡ基因的转化黄瓜植物的转化和再生已由Trulson等报道(1986，Appl.Genet.73∶11-15)。用土壤致癌杆菌感染黄瓜的下胚轴部分来转移双栖质粒pARC8的T-DNA区可完成此转化。pARC8含有Nos-NPTⅡ基因。通过胚胎发育过程，所得的转化组织再生出根。SMalepepsy，K.Niemirowicz-Szcytt，andJ.Wiezniewska(1982)“Cucumber(CucumisSativasL.)SomaticembryogenesisinVitro”，ActaBiologica10∶218-220P.CheeandD.Tricoli(1988)“SomaticembryogenesisandPlantregenerationfromcellsuspensionsofCucumisSativasL.”，PlantCellReports7∶274-277。此文所用的下述术语意为“Plantlet”-小植物，表示一个植物充分发育至有一个茎和一个根，此根和茎由细胞培养无性繁殖产生。“Explant”-外植体，表示用于培养的一段或一片组织，此组织来自一个植物或小植物的任一部位，不管是野生的还是人工培养的、杂交的(体细胞性或性细胞性)、遗传变异的或转化的。“Hormone”-激素，表示一种外源性的、影响植物生长或分化的调节物质，可用于不同的培养基。“Callus”或其复数“Calli”-胼胝体，指对一植物的砍伤、切断伤或其他损伤反应而形成一无组织细胞团，本文意指在培养过程中在外植物上形成的无组织细胞团。“Embryoid”-胚状体，意指和植物合于胚相似的结构。“Medium”-培养基，指为此学科所公知的、对植物组织培养有用的培养基。“Kinetin”-激动素，是一已知激素2，4-D＝2，4双氯苯氧乙酸NAA＝α-萘乙酸MSMedium＝Murashige和Skoog培养基(Mura-shige和skooy，1962)本专利技术提供一种由子叶或下胚轴的黄瓜外植体产生黄瓜胚状体的方法。此方法包括在由MS培养基、外源性激素和2，4-D及激动素组成的诱导培养基上培养外植体4-5周，以便产生具有成活力的胚状体。由此法提供的胚状体可以是基因转接的或不是基因转接的。使用土壤杆菌作为载体或用显微投射轰击法引导外源DNA进入植物体中，制得基因转接胚状体。还提供一种产生黄瓜突变植物的方法，该方法包括使按权利要求18方法产生的胚状体转化，得到完整的转化植物。还提供由黄瓜植物组织、诱导培养基，2，4-D和激动素组成的组合物。总的来说，此专利技术的方法涉及表1所示的步骤。外植体及其制备将黄瓜种子(CucumisSativusL.cv.Poinsett76，AsgrowSeedCo.)浸泡于自来水中约15分钟，用手去除种壳。去壳的种子表面用70%的乙醇消毒1分钟，接着用25%(V/V)的市售漂白剂(5.25%次氯酸钠)处理25分钟，然后，用无菌蒸馏水冲洗种子4次。消毒过的种子于28℃，黑暗中，在0.8%的水琼脂(DitcoLaboratories)中发芽。除非有其他说明，所有培养基均加有3%的蔗糖，用0.8%的植物琼脂(Gibco)固化。在高压灭菌前，所有培养基的PH都调至5.8。全部培养基在121℃下高压灭菌20分钟。实施例1胚状体的诱导和植物再生在体外生长3-5天的幼苗用作组织来源。将子叶组织块(5×5mm)和下胚轴段(0.6至1mm长)用作外植体。约100个外植体在加有2，4-D(1.0、2.0mg/l)和激动素(0.5、1.0、2.0mg/l)的诱导培养基中，于26℃，黑暗中培养4周。四周后，评价培养所产生的组织类型和频数。然后将培养物转移到加有1.0mg/升NAA和0.5mg/升激动素的MS培养基中。这些培养物于26℃、在具有16个小时光照期的弥散冷白色荧光灯下(4KLX)再培养2周。随后把组织转移到无生长调节物的MS培养基中。当小植物在后来的培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
从来源于子叶或下胚轴组织的黄瓜外植体生产黄瓜胚状体的方法，此法包括在由ＭＳ培养基、外源性激素、２，４－Ｄ和激动素组成的诱导培养基中培育外植体４－６周，得到具有成活能力的胚状体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：保娜P姬，
申请(专利权)人：厄普约翰公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]