一种高山被孢霉重组基因表达系统及其构建方法和应用技术方案

本发明专利技术涉及一种高山被孢霉（Mortierella?alpina?ATCC?32222）的重组基因表达系统及应用。本发明专利技术采用高山被孢霉ATCC?32222尿嘧啶营养缺陷型菌株为材料，运用根癌土壤杆菌介导的遗传操作技术进行基因操作，构建了一套高山被孢霉重组基因表达系统。并运用这套系统操作，得到多株高产多不饱和脂肪酸高山被孢霉菌株，对产油真菌高山被孢霉ATCC?32222的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种高山被孢霉重组基因表达系统及其构建方法和应用【
】本专利技术涉及一种高山被孢霉的重组基因表达系统及其构建方法和应用，属于生物工程
。【
技术介绍
】高山被孢霉是一种重要的产油丝状真菌，它具有花生四烯酸(AA)含量高、安全、多不饱和脂肪酸(PUFAs)组成合理等特点，已经应用于工业生产AA。目前对高山被孢霉高产菌株的研究主要集中在菌种选育和发酵条件优化等方面。由于缺乏一种有效的高山被孢霉的基因操作系统，目前还不能对这种极具价值的丝状真菌进行遗传改造。这就为高山被孢霉脂肪酸合成途径的基础理论研究和基因工程生产菌株的构建构成了不可逾越的障碍。丝状真菌的基因操作系统一直落后于其它物种而没有被很好地建立起来，主要归咎于丝状真菌难以被转化的特点。尤其以具有高山被孢霉这类特点的真菌最难以被转化:多核，无隔，产孢能力低且对抗生素不敏感。因此，国内一直未见这种重要的工业生产微生物遗传改造的报道。除了不同丝状真菌种类自身的特点及偏好性，转化方法的选择也是决定丝状真菌能否被转化的关键因素。目前，丝状真菌的转化和方法主要由以下几种:原生质体转化，电穿孔转化，基因枪转化和农杆菌介导转化方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用含苹果酸酶基因的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。

【技术特征摘要】
1.一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用含苹果酸酶基因的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。2.根据权利要求1所述的一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用包含质粒pBIG2-ura5s_malEl或质粒pBIG2-ura5s_malE2的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。3.根据权利要求1或2所述的一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用重组质粒pBIG2-ura5s_malEl或pBIG2-ura5s_malE2转化根癌土壤杆菌后，进一步用经转化的含质粒pBIG2-ura5s_malEl或pBIG2-ura5s_malE2的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的，其中的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是ura5基因中的213bp_230bp之间共18bp的序列缺失的Mortierellaalpina ATCC32222 菌株。4.一种构建权利要求1或2所述的同源重组高山被孢霉菌株的方法，其具体步骤如下: a)提取Mortierellaalpina ATCC32222菌株的RNA，通过反转录获取cDNA,利用PCR扩增分别获取ura5基因、内含子DNA片段IT、苹果酸酶I基因malEl和苹果酸酶2基因malE2 ；b)分别构建重组质粒pBIG2-ura5s_malEl 和 pBIG2-ura5s_malE2 ； c)分别用构建获得的重组质粒pBIG2-ura5s_malEl或pBIG2-ura5s_malE2转化根癌土壤杆菌； d)分别用经过转化的含质粒pBIG2-ura5s_malEl或pBIG2-ura5s_malE2的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株； e)筛选鉴定转化菌株，获得过量表达苹果酸酶I或2基因的同源重组高山被孢霉菌株。5.一种根据权利要求4所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于步骤c)中所使用的根癌土壤杆菌为:Agrobacteriumtumefaciens C58C1。6.一种根据权利要求5所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于步骤d)中所使用的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是ura5基因中的213bp_230bp之间共18bp 的序列缺失的 Mortierella alpina ATCC32222 菌株。7.一种根据权利要求6所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于构建pBIG2-ura5s-malEl时，先利用ura5基因构建转化质粒pBIG2_ura5s，再利用转化质粒pBIG2-ura5s和苹果酸酶I基因malEl进一步构建重组质粒pBIG2-ura5s_malEl ;构建PBIG2-ura5s-malE2时，先利用转化质粒pBIG2_ura5s和IT基因片段构建转化质粒高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-1Ts，再利用转化质粒pBIG2-ura5s_ITs和苹果酸酶2基因malE2进一步构建重组质粒pBIG2-ura5s_malE2。8.一种根据权利要求6所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于构建pBI...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永泉，陈卫，郝光飞，陈海琴，郝丹辉，赵山山，赵建新，顾震南，张灏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：