一种头孢霉素C的制备方法及其所用的基因工程菌技术

本发明专利技术公开了一种头孢霉素C的制备方法及其所用的基因工程菌，还公开了该基因工程菌的制备方法。所述孢霉素C的制备方法包括以下步骤：(1)将携带如序列表中SEQ ID NO：1所示的核酸的重组表达载体转染顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)，获得重组表达转化体；(2)发酵培养所得重组表达转化体，从培养物中分离头孢霉素C即得。本发明专利技术通过在顶头孢霉CPC高产菌株额外引入AcveA基因，有效提高了CPC合成基因的转录水平，从而通过导入CPC合成调控基因AcveA提高了CPC的产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种头抱霉素C的制备方法及其所用的基因 工程菌。
技术介绍
头抱菌素C(CPC)是生产头抱菌素类抗生素重要中间体7-氨基头抱焼酸（7-ACA) 的主要原料。顶头抱霉是发酵产CPC的一类重要工业微生物。经过多年研究，CPC在顶 头抱霉体内的生物合成途径已被阐述得较为清楚，其中涉及的所有合成基因都已克隆得 至Ij,且纯化获得了送些基因编码的大部分酶（请参见文献MartinJF.Alpha-aminoadipyl -cysteinyl-valinesynthetasesinbeta-lactamproducingorganisms.FromAbraham'S discoveriestonovelconceptsofnon-ribosomalpeptidesynthesis.JAntibiot(T okyo)，2000, 53 (10) : 1008-1021)。研究发现，CPC生物合成途径中的基因为成簇排列，主要 分为两部分，一是位于7号染色体上的早期基因簇：包括合成基因pcbAB、pcbC、Ce巧1W及 Ce巧2 ;二是位于1号染色体上的晚期基因簇，由同一个双向启动子启动的合成基因Ce巧F 矛口CefG组成(请参见文献GutierrezS,FierroF,CasqueiroJ,etal.Ge打eorganization andplasticityofthebeta-lactamgenesindifferentfilamentousfungi.Antonie VanLeeuwenhoek, 1999, 75(1-2) :81-94.)。这些基因直接影响了顶头抱霉最终发酵产物中 CPC的含量。 随着CPC生物合成主要途径的阐明，合成途径中的基因调控及其调控机制 受到了许多研究者的关注。近年已发现在CPC生物合成过程中起重要作用的一些调 控蛋白，如对CPC合成起正调控作用的CPCRl(请参见文献SchmittEK，KuckU.Ilie fungalCPC民！protein,whichbindsspecificallytobeta-lactambiosynthesis ge打es,isrelatedtohuma打regulatoryfactorXtra打scriptio打factors. JBiolChem，2000, 275 (13) : 9348-9357.)、AcFKHl(请参见文献SchmittEK，Hoff B,KuckU.AcFKHl,anovelmemberoftheforkheadfamily,associateswiththe民FX transcriptionfactorCPC民IinthecephalosporinC-producingfungusAcremonium chrysogenum.Gene，2004, 342(2) :269-281.)和PacC(请参见文献Schmitt BK,Kempken民，KuckU.Functionalanalysisofpromotersequencesofcephalosporin CbiosynthesisgenesfromAcremoniumchrysogenum:specificDNA-protein interactionsandcharacterizationofthetranscriptionfactorPACC.MolGenet Genomics, 2001，265 (3) : 508-518.)，W及负调控子Crel(请参见文献JekoschK，Kuck U.GlucosedependenttranscriptionalexpressionofthecrelgeneinAcremonium chrysogenumstrainsshowingdifferentlevelsofcephalosporinCproduction.Curr Genet, 2000, 37巧）：388-395.)。与构巢曲霉veA基因同源的AcveA是近年来在顶头抱霉 中发现的一个全局性调控子，其调控了pcbAB、pcbC、cefDl、cefD2、cefEFW及CefG全部6 个主要的CPC生物合成基因的转录水平，敲除该基因会大幅度降低CPC的产量（请参见文 献DreyerJ,EichhornH,FriedlinE,etal.AhomologueoftheAspergillusvelvetgene regulatesbothcephalosporinCbiosynthesisandhyphalfragmentationinAcremonium chrysogenum ?ApplEnvironMicrobiol, 2007, 73(10):3412-3422.)O
技术实现思路
因此本专利技术所要解决的技术问题是，针对目前存在的菌株头抱霉素C产量不高的 问题，提供了一种新的头抱霉素C的制备方法及其所用的基因工程菌。 为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之一是；一种头抱霉素C的制备方 法，所述制备方法包括W下步骤： (1)将携带如序列表中SEQIDNO;1所示的核酸的重组表达载体转染顶头抱霉菌 (AcremoniumC虹ysogenum)，获得重组表达转化体； 似发酵培养步骤（1)所得重组表达转化体，从培养物中分离头抱霉素C即得。 本专利技术所述SEQIDNO;1所示的核酸序列为AcveA基因。本专利技术所述核酸的制备 方法为本领域常规制备方法，所述核酸的制备方法较佳地包括：从生物体中提取天然存在 的核酸分子，通过基因克隆技术获得该核酸分子，或者通过人工合成序列的方法得到所述 核酸分子。 其中步骤（1)所述顶头抱霉菌（AcremoniumC虹ysogenum)为本领域常规的顶头 抱霉菌，优选地为CPC高产顶头抱霉菌CPCC480085。所述CPC高产顶头抱霉菌CPCC480085 的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为多轮诱变筛选所得，或者通过商业购买所得。 其中步骤（1)所述重组表达载体可通过本领域常规方法将本专利技术的所述的核酸 或其突变体的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的 各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、瞻菌体或病毒载体等，本专利技术所述载体优 选地为携带如序列表中SEQIDNO;1所示的核酸的PYG858质粒。 本专利技术所述PYG858质粒的制备方法为本领域常规制备方法（该质粒的具体制备 方法请参见文献；张丕燕，朱春宝，朱宝泉.顶头抱霉PCbAB-pcbC双向启动子区域的克隆 与应用.微生物学报，2004, 44 (2) : 255-257.)。 其中步骤（2)所述发酵培养包括W下步骤；将步骤（1)所述重组表达转化体接 种于种子培养基中，温度25-3(TC，种子培养3-5天；将所得培养物转接至发酵培养基中， 20-25C发酵培养5-10天。 本专利技术所述种子培养基为本领域用于培养顶头抱霉菌的常规种子培养基，所述 种子培养基的配方较佳地包括W下组分：玉米浆6%，藏糖3. 5 %，葡萄糖0. 5 %，硫酸倭 0.8%，甲硫氨酸0. 05 %，CaC〇3〇. 5 %，豆油1 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种头孢霉素C的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)将携带如序列表中SEQ ID NO：1所示的核酸的重组表达载体转染顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)，获得重组表达转化体；(2)发酵培养步骤(1)所得重组表达转化体，从培养物中分离头孢霉素C即得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡又佳，龚桂花，张伟，刘艳，谢丽萍，朱宝泉，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海;31