本发明专利技术涉及一种异源表达内切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其应用，所述的工程菌携带有能表达特异腐质霉(Humicola?insolens)的内切葡聚糖酶的表达载体。本发明专利技术的木霉工程菌能高效表达特异腐质霉(Humicola?insolens)的内切葡聚糖酶基因，从而增加了其纤维素酶系的内切酶组分，改变了酶学pH特性，明显扩大了其纤维素酶系在中性和碱性条件下的适用范围；本发明专利技术生产的纤维素酶产品在pH?4.0-8.0范围内，无需调酸可直接应用于水洗做旧、织布抛光等纺织工业领域，且效果良好，从而简化了应用工艺，节约成本。
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术属于微生物工程
，具体涉及一种异源表达内切葡聚糖酶基因的工程菌株及其应用。
技术介绍
纤维素是由β -1，4-糖苷键连接而成D-吡喃式葡萄糖聚合物，是地球上最丰富且可再生的资源。据估计，地球上每年光合作用产生1.5 X IO11亿吨纤维素(Ryu，D.D等，1980，Enzyme and Microbial Technology)。多数情况下,要高值化利用纤维素首先必须通过纤维素酶对其进行有效降解。自然界中产纤维素酶的生物很多，主要是微生物，如丝状真菌、细菌和放线菌等。因此，对产纤维素酶微生物的筛选或遗传改造研究及应用就受到了普遍的关注。自然界中各种微生物所产的纤维素酶组分和比例不尽相同，例如丝状真菌纤维素酶系(Cellulase system) 一般包括3种水解酶，即内切型β _1，4_葡聚糖(Endoglucanase, EC3.2.1.4)、外切型 β -1,4-葡聚糖酶(Exo-glucanase, EC3.2.1.91)和β _ 葡萄糖苷酶(β -Glucosidase, EC3.2.1.21) (Fogarty M, Kelly C Τ, 1990, MicrobialEnzymes and Biotechnology), 3种纤维素酶组分协同作用才能将纤维素水解成葡萄糖。其中木霉(Trichoderma sp.)作为工业化生产纤维素酶的菌株，其纤维素酶系中有2个外切酶组分(Cbh I和Cbh II)和5个内切酶组分(Eg 1、Eg II,Eg III,Eg IV和Eg V)。由于木霉具有高效分泌表达和高密度发酵等优点，常被用来构建工程菌生产其它工业酶。而利用基因工程手段高效表达外源基因，也是改变木霉宿主酶系组成的重要方法之一，如通过高效表达异源β_葡萄糖苷酶基因，可以有效弥补木霉纤维素酶系中β_葡萄糖苷酶的不足，提高菌株的滤纸酶活(Jiwei Zhang等,2010, Bioresource Technology)。目前,纤维素酶系中的各组分均可在木霉中得到有效表达需要提及的是，木霉纤维素酶系的最适pH值为4.5-5.5，在近中性和碱性条件下(pH6.5-8.0)几乎没有效果。因此，在织布除毛、牛仔布磨损和洗旧的现有工艺中，必须先调pH至酸性，再加纤维素酶。为了进一步简化工序,节约生产成本和劳动量,急需通过遗传工程方法获得在中性和碱性条件下适用的纤维素酶系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种异源表达内切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其应用，即利用基因工程手段，将特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶基因转化入木霉中，构建木霉工程菌株。该工程菌能高效表达内切葡聚糖酶基因，从而增加了其纤维素酶系的内切酶组分，提高了酶活性；而意想不到的是，与未转化的木霉相比，本专利技术构建的木霉工程菌的纤维素酶系的PH适用范围得到了显著扩大，可以在中性或偏碱性条件下直接应用。申请人:在经过长期的筛选后发现 ，将来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶基因转化入木霉中，木霉纤维素酶系的pH适用范围得到了显著扩大，从而促成了本专利技术。本专利技术的一个方面涉及一种木霉工程菌，该工程菌携带有能表达特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶的表达载体。所述的木霉为里氏木霉(Trichoderma reesei)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)中的任一种。其中里氏木霉YFZX-1 (hph+, egV) (Trichoderma reesei YFZX-1 (hph+, egV))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于地址为武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山的“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO:M 2011469。康氏木霉YFZX-2 (egv) (Trichoderma koningii YFZX-2 (egv))工程菌，已于 2011年12月13日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO:M 2011470。绿色木霉YFZX-3 (hph+, egV) (Trichoderma viride YFZX-3 (hph+, egV))工程菌，已于2011年12月13日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO:M 2011471。上述的特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶,其特征在于:I)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的内切葡聚糖酶；2)在I)中限定的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有特异腐质霉的内切葡聚糖酶功能的，由I)衍生的蛋白质。上述的特异腐质霉的内切葡聚糖酶的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。所述的表达载体，其启动子序列为木霉cbhl启动子，终止子序列为木霉cbhl终止子，筛选标记为潮霉素，其一种图谱如图1所示。本专利技术另一方面涉及上述木霉工程菌的应用，用于生产纤维素酶系，所述纤维素酶系可在中性或碱性条件下适用。上述生产的纤维素酶在纺织工业领域中的应用，尤其在针织面料、梭织面料的表面除毛，针织面料、梭织面料的除毛染色一浴工艺，针织面料、梭织面料的除毛除氧一浴工艺以及牛仔面料的起花及除毛等领域的使用方法。本专利技术的木霉工程菌能高效表达特异腐质霉(Humicola insolens)的内切葡聚糖酶基因，从而增加了其纤维素酶系的内切酶组分，改变了酶学PH特性，明显扩大了其纤维素酶系在中性和碱性条件下的适用范围；本专利技术生产的纤维素酶产品在PH 4.0-8.0范围内，无需调酸可直接应用于水洗做旧、织布抛光等纺织工业领域，且效果良好，从而简化了应用工艺，节约成本。附图说明图1:构建的重组表达载体不意图；图2:PCR扩增鉴定转化子的电泳图；其中:A为PCR扩增潮霉素基因部分序列；B为PCR扩增目的基因；图3 =SDS-PAGE鉴定木霉工程菌所表达的目的蛋白:箭头所示为内切葡聚糖酶。图4:木霉工程菌YFZX-1所产纤维素酶的pH特性分析。具体实施例方式下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1特异腐质霉内切葡聚糖酶基因的克隆1.1提取特异腐质霉总基因组DNA将特异腐质霉(Humicola sp.)过夜培养,取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心 5min，弃上清；加入 400 μ I 抽提缓冲液(IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, 250mM NaCl, I %SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种木霉工程菌，为携带有能表达特异腐质霉(Humicola?insolens)内切葡聚糖酶的表达载体的木霉。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄亦钧，张青，王华明，许韡，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，上海康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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