一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法技术

本发明专利技术公开了一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术方法为通过RNAi降低里氏木霉木聚糖酶基因、纤维素内切酶基因的表达，具体包括如下步骤：将两端有限制性内切酶识别位点且含有SEQ ID NO.1所示序列的干扰片段通过相应限制性内切酶和DNA连接酶构建到pSilent‑1上；将所构建的重组载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉纤维素酶酶活得到提高。本发明专利技术通过RNAi干扰序列的合理设计，不仅显著降低木聚糖酶的表达，还适度降低纤维素内切酶的表达、增强葡糖苷酶的表达，优化了纤维素酶酶系中三种酶的活性比例，提高了里氏木霉纤维素酶酶活。

Method for improving cellulase activity of Trichoderma viride by double gene interference

The invention discloses a method for raising cellulase activity of Trichoderma viride by double gene interference, belonging to the field of gene engineering technology. The method of the invention is to reduce the expression of Trichoderma reesei xylanase gene, cellulose enzyme gene by RNAi, and includes the following steps: two interference fragment restriction endonuclease recognition site and contains SEQ ID NO.1 sequences shown by corresponding restriction endonuclease and DNA ligase to construct recombinant vector pSilent 1; the conversion to trichodermareesei, improve the activity of Trichoderma reesei cellulase enzyme transformed with recombinant vector. The reasonable design of the invention by RNAi interference sequence, not only significantly reduce the expression of xylanase, cellulose enzyme also moderately reduced expression, enhanced expression of glucosidase activity, optimize the proportion of the three kinds of cellulase enzymes and improve the cellulose enzyme activity of Trichoderma reesei.

【技术实现步骤摘要】
一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。
技术介绍
里氏木霉纤维素酶是一种广泛应用的酶类，里氏木霉具有胞外表达酶量大等优点，是工业生产酶制剂中广泛应用的菌种。里氏木霉产生的纤维素酶酶系组成中，葡糖苷酶的活力相对较低。已有的提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法是通过基因工程的手段导入纤维素葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。目前这些方法中，每次只能剔除一个基因或增强一个基因的表达。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，以及通过该方法得到的里氏木霉菌株。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，为通过RNAi降低里氏木霉木聚糖酶基因、纤维素内切酶基因的表达，提高里氏木霉纤维素酶酶活。优选的，所述的双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：（1）将两端有限制性内切酶识别位点且含有SEQIDNO.1所示序列的干扰片段通过相应限制性内切酶和DNA连接酶构建到pSilent-1上。（2）将步骤（1）构建的重组载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉纤维素酶酶活得到提高。步骤（1）中所述的限制性内切酶优选为SnaBI和ApaI。步骤（2）优选通过农杆菌将所构建的重组载体转化到里氏木霉中。步骤（2）中所述的里氏木霉优选为里氏木霉ATCC24449。一种里氏木霉菌株，为上述转化有重组载体的里氏木霉。本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术通过RNAi干扰序列的合理设计，不仅显著降低木聚糖酶的表达（不表达），而且还适度降低纤维素内切酶的表达、增强葡糖苷酶的表达，优化了纤维素酶酶系中三种酶的活性比例，提高了里氏木霉纤维素酶酶活。木聚糖酶表达的消失也有利于葡糖苷酶表达量的增加和纤维素酶的纯化。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例11、材料里氏木霉ATCC24449，质粒pSilent-1（Biovector），农杆菌EHA105，大肠杆菌DH5α，限制性内切酶（TakaRA）等。合成的两端有SnaBI、ApaI酶切位点的干扰片段1（SEQIDNO.1），序列组成为：GGTACGTA（SnaBI酶切位点序列）-木聚糖酶mRNA互补片段1序列（SEQIDNO.2）-纤维素内切酶mRNA互补片段序列（SEQIDNO.4）-内含子片段序列（SEQIDNO.6）-纤维素内切酶mRNA互补片段的反义序列（SEQIDNO.7）-木聚糖酶mRNA互补片段1的反义序列（SEQIDNO.9）-GGGCCCGG（ApaI酶切位点序列）。2、方法一、重组质粒的构建（1）质粒pSilent-1的提取含有pSilent-1的大肠杆菌DH5α接种到含有氨苄霉素的LB培养基（LB培养基：氯化钠1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，121℃灭菌20min，加入微孔过滤的氨苄霉素，氨苄霉素在LB中的终浓度为30µg/mL）中，35℃培养过夜。使用质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司，DP103）按照说明书说明提取pSilent-1质粒，提取步骤如下：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2）取2mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm（13400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm（13400×g）离心10min。6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7）可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。8）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。9）重复操作步骤8）。10）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm（13400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。（2）质粒pSilent-1、干扰片段1的酶切和电泳往41μLpSilent-1质粒溶液或干扰片段1溶液中加入2μLSnaBI、2μLApaI和5μL酶切缓冲液，总体积为50.0µL，在30℃酶切2h。使用琼脂糖凝胶电泳试剂盒（上海一基实业有限公司）进行电泳。1）打开试剂盒，依照说明书清点各种试剂，并按实验需要量将50×电泳缓冲液稀释为1×电泳缓冲液待用；将核酸荧光染料与6×LoadingBuffer按1:1比例混合备用。2）把U型凝胶托盘放入制胶槽中，插好梳子，置于一水平面上。3）将0.25g琼脂糖加到盛有适当体积1×电泳缓冲液的三角瓶或玻璃瓶中（常用凝胶浓度0.8-1.2%）。4）将瓶口用封口膜轻轻盖住，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖完全熔化（熔化到没有小颗粒物为止）。5）将温热的凝胶溶液倒入U型凝胶托盘中（超过二分之一处）。6）将凝胶室温放置15-30min完全冷却至凝固，小心拔除梳子，将凝胶托盘移入电泳槽，梳井（点样孔）一端朝负极方向，加入1×电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没。7）将样品与6×LoadingBuffer和核酸荧光染料充分混合（20μL样品+1μL6×Loadi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，其特征在于：所述的方法为通过RNAi降低里氏木霉木聚糖酶基因、纤维素内切酶基因的表达，提高里氏木霉纤维素酶酶活。

【技术特征摘要】
1.一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，其特征在于：所述的方法为通过RNAi降低里氏木霉木聚糖酶基因、纤维素内切酶基因的表达，提高里氏木霉纤维素酶酶活。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将两端有限制性内切酶识别位点且含有SEQIDNO.1所示序列的干扰片段通过相应限制性内切酶和DNA连接酶构建到pSilent-1上；（2）将步骤（1）构建的重组载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，曾徐浩，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42