本发明专利技术提供了一种提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的方法，其中，包括以下步骤：一级种子培养：将PDA斜面培养基上活化后的里氏木霉(Trichoderma?reesei?CICC?13052)菌株制备成孢子悬液，按照3％的接种量接种于新鲜的种子培养基中进行培养；发酵培养：将处于对数生长期的一级种子液按照5％接种量接种至新鲜的发酵培养基中进行培养，分段控制发酵过程中罐内的pH值和溶解氧，使pH值和溶解氧在不同时段维持在不同的水平，并进行补料控制培养。通过本发明专利技术的方法发酵168小时结束，采用国际理论与应用化学联合会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，得到滤纸酶活为14.2IU/mL，比工艺优化前间歇发酵酶活水平(8.5IU/mL)提高了67.1％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种里氏木霉纤维素酶的发酵方法，特别是涉及一种能够提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的方法。
技术介绍
纤维素类物质是地球上最丰富的多糖物质，也是自然界中最具潜力的一种可再生资源，其有效利用是目前人们关注的热点。作为降解纤维素生成葡萄糖的多组分酶系，纤维素酶降解纤维素的优点在于特异性高，反应条件温和，环境污染小。因此，为了更好地利用纤维素类物质，纤维素酶的研究与应用得到了愈来愈多国内外学者的关注。纤维素酶已被广泛应用于纺织、食品发酵、饲料、农副产品深加工、造纸、医药、日用化工、环境保护和中草药提取等诸多领域。特别是在秸秆生产燃料乙醇方面，具有巨大的潜在价值及显著的综合社会效益，其前景十分广阔，纤维素酶的研究已成为一个战略性课题。自然界中广泛存在着能降解纤维素的微生物，它们种类繁多，包括细菌、真菌和放线菌等。现有的纤维素酶生产方法主要是采用产纤维素酶的微生物进行液体发酵制备， 其中以里氏木霉(Trichoderma reesei)及其近缘的菌株应用最为广泛。目前，纤维素酶的生产被全球两个最大的酶制剂公司(诺维信和杰能科)所垄断，而国内的纤维素酶技术水平较之还有一定的差距。主要是现有的纤维素酶分批发酵菌体生长稳定期短、发酵周期长、产酶水平低、生产成本高，使其难以实现工业化应用。针对这些问题，中国专利 200910091968. 9,201010040047. 2等报道采用补料培养及控制溶氧的方法以提高里氏木霉产纤维素酶水平，但他们的补料培养基中均加入了纤维素酶的高效诱导物槐糖，且加入量较高，槐糖价格昂贵，不适合工业化大规模生产。因此，低成本、高效的纤维素酶生产工艺仍是目前亟待解决的问题。本专利技术通过对里氏木霉纤维素酶的液体发酵过程中底物消耗、菌体生长及产酶情况进行深入研究，提出了一种提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的工艺控制方法。 有效延长了里氏木霉菌株的生长稳定期，提高了纤维素酶发酵水平。该工艺操作简单，方法易行，适合大规模工业化生产。
技术实现思路
本专利技术提供的一种提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的工艺控制方法包括以下步骤1)将里氏木霉(Trichoderma reesei CICC 13052)菌株或其衍生菌株或其突变株接种于PDA斜面，于观 32°C恒温培养箱中培养6 7天。幻将PDA斜面培养基上活化后的iTrichoderma reesei CICC 13052菌株或其衍生菌株或其突变株制备成浓度为IO6 IO9个/mL的孢子悬液，按照3%的接种量接种于新鲜的种子培养基中，于观 30°C，转速170 200转/分的摇床上震荡培养。3)将培养M 36h的种子液按照5%接种量接种至新鲜的发酵培养基中进行培养，分段控制及补料策略如下发酵开始至M 36小时对发酵罐内pH和溶解氧不加控制， 24 36小时后控制发酵液pH维持在4. 5 5. 5，M 90小时控制发酵液中溶解氧维持在 25 55%，90小时后维持在15 30%直至发酵结束。发酵36 48小时后，以一次性加入、分批加入、流加或分批与流加相结合的方式加入新鲜补料培养基直至72 90小时。4)培养140 200小时后，停止发酵，采用国际理论与应用化学联合会(IUPAC)推荐的国际标准方法检测发酵液的纤维素酶活力。本专利技术提供的提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的工艺控制方法具有以下突出特点本专利技术采用的分段控制发酵条件及补料发酵的策略，是通过对里氏木霉纤维素酶的液体发酵过程中底物消耗、菌体生长及产酶情况以及PH和溶解氧的变化情况进行全面研究后，制定的有针对性的工艺优化控制方法，可有效延长菌体生长稳定期，使液体发酵纤维素酶活力提高了 40 100%。本专利技术操作工艺简单，方法易行，是实现提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的有效手段，适合于大规模工业化生产。同时，对其他液体发酵产品的过程控制与工艺优化也具有一定的借鉴意义。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。本专利技术中所用的菌种里氏木霉(Trichodermareesei CCIC 13052)ATCC56765 由中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)购得。实施例1 将里氏木霉(Trichoderma reesei CICC 13052)菌株接种于PDA斜面，于30°C恒温培养箱中培养6天。然后将PDA斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为2X107个/mL 的孢子悬液，按照3%的接种量接种于新鲜的种子培养基中，于^°C，转速180转/分的摇床上震荡培养。其中，种子培养基组成为微晶纤维素1 %，玉米浆1.5%，葡萄糖1 %，调节 ρΗ*4·8。将培养M小时后的种子液按照5%接种量接种至新鲜的发酵培养基中(5L发酵罐装液量为2. 5L)进行培养，分段控制及补料策略如下发酵开始至M小时对发酵罐内pH 和溶解氧不加控制，M小时后控制发酵液pH维持在4. 8,24 84小时通过调节搅拌转速和通气量控制发酵液中溶解氧维持在35 40%，84小时后维持在20 30%直至发酵结束；在发酵42小时后，一次性加入500mL新鲜补料培养基。其中，发酵培养基的组成为微晶纤维素 4%，玉米浆 3%，(NH4)2SO4 0. 4%, KH2PO4 0.6%，甘油 0.4%，CaCO3 0. 5%, MgSO4 0. 1%，调节初始pH 4. 5 ；补料培养基组成与发酵培养基一致。发酵144小时结束，采用国际理论与应用化学联合会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，得到滤纸酶活为11.6IU/mL，比工艺优化前间歇发酵酶活水平(8.2IU/ mL)提高了 41. 5%。实施例2:将里氏木霉CTrichoderma reesei CICC 13052)菌株接种于PDA斜面，于恒温培养箱中培养7天。然后将PDA斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为IO8个/mL的孢子悬液，按照3%的接种量接种于新鲜的种子培养基中，于^°C，转速200转/分的摇床上震荡培养。其中，种子培养基组成为微晶纤维素2%，玉米浆1.5%，葡萄糖1 %，调节pH 为 4. 5。将培养28小时后的种子液按照5%接种量接种至新鲜的发酵培养基中(5L发酵罐装液量为2. 5L)进行培养，分段控制及补料策略如下发酵开始至36小时对发酵罐内pH 和溶解氧不加控制，36小时后控制发酵液pH维持在5. 0，M 90小时通过调节搅拌转速和通气量控制发酵液中溶解氧维持在30 50%，90小时后维持在25 30%直至发酵结束； 在发酵36 72小时阶段内，每隔8小时分批加入新鲜补料培养基共500mL。其中，发酵培养基的组成为微晶纤维素5%，玉米浆2.7%，(NH4)2SO4 0.6%,KH2PO4 0.5%，甘油0.5%， CaCO3 0. 3%, MgSO4 0. 12%，调节初始pH 4. 5 ；补料培养基组成与发酵培养基一致。发酵168小时结束，采用国际理论与应用化学联合会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，得到滤纸酶活为14. 2IU/mL,比工艺优化前间歇发酵酶活水平(8. 5IU/ mL)提高了 67. 1%。实施例3 将里氏木霉CTr本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的方法，其中，包括以下步骤：一级种子培养：将ＰＤＡ斜面培养基上活化后的里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＣＩＣＣ １３０５２）菌株或其衍生菌株或其突变株制备成孢子悬液，按照第一百分比行补料控制培养。的接种量接种于新鲜的种子培养基中进行培养；发酵培养：将处于对数生长期的一级种子液按照比第一百分比大的第二百分比的接种量接种至新鲜的发酵培养基中进行培养，分段控制发酵过程中罐内的ｐＨ值和溶解氧，使ｐＨ值和溶解氧在不同时段维持在不同的水平，并进
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈树林，马立娟，李晨，贾文娣，武改红，
申请(专利权)人：天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：12
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