一种提高酿酒酵母纤维乙醇发酵性能的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高酿酒酵母纤维乙醇发酵性能的方法，所述方法是将酿酒酵母的JJJ1基因敲除；本发明专利技术方法可以高效地获得对纤维素水解液抑制物耐性显著提升的酿酒酵母工程菌株，在多种抑制物(乙酸、糠醛、甲酸和5-羟甲基糠醛)存在时乙醇发酵速率明显提高，发酵时间缩短20h以上。该发明专利技术方法获得的酿酒酵母工程菌株更加适用于纤维素燃料乙醇发酵生产工艺。

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及一种纤维乙醇发酵的方法，特别涉及一种提升酿酒酵母纤维乙醇发酵 性能的方法。 二、
技术介绍
由于石油、天然气和煤炭等化石燃料的储量有限和用量急增，伴随着环境污染等 系列问题，利用可再生物质生产清洁能源越来越被世界各国重视。生物燃料是具有良好发 展前景的可再生能源，其中以燃料乙醇发展最为迅速。纤维素是自然界中分布最广、含量最 多的一种多糖，可以水解成葡萄糖，用于燃料乙醇的生产。利用纤维素生产燃料乙醇，既有 助于缓解化石燃料短缺，改善环境，也有利于整个社会的可持续发展，实现人与环境的和谐 相处。 当前，在纤维素原料预处理过程中（蒸汽爆破和酸处理），由于酸和热的作用，会 产生甲酸、乙酸、糠醛等一系列有害物质，其中乙酸所占比例最大。这些抑制物在高浓度条 件下会引起酵母细胞的生理代谢失衡甚至死亡，从而极大地限制纤维乙醇发酵效率。因此， 很有必要选育具有高抑制物耐受性的酿酒酵母菌株。通过寻找与细胞胁迫耐性相关的基 因，对酿酒酵母菌株进行基因工程改造，是提升酵母燃料乙醇发酵效率的一种重要育种策 略。酿酒酵母JJJl基因是热击蛋白HSP40家族中的一员，已有研究表明该基因编码的蛋白 可激活蛋白Ssalp的ATPase酶的活性，参与核糖体大亚基的合成，但未见关于该基因与纤 维素水解液中抑制物耐受性关系的报道。 三、
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，具体是构建纤 维素水解液高浓度抑制物耐受性的酿酒酵母菌株的方法，从而使其可以在高浓度抑制物存 在条件下快速高效的进行乙醇发酵，以改进现有技术中酿酒酵母发酵生成纤维乙醇受到乙 酸、糠醛、甲酸和5-羟甲基糠醛等抑制物影响的问题。 本专利技术提供，所述方法是将酿酒酵 母的JJJl基因敲除（JJJl基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示，JJJl基因上下游延长 IOOObp的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示）。 进一步，所述JJJl基因敲除是以PUG6质粒为PCR模板，在引物JJJlS和引物JJJlA 的作用下进行PCR扩增，获得2038bp的DNA片段作为JJJl基因敲除组件，然后将敲除组件 转入酿酒酵母，即获得提高纤维乙醇发酵性能的酿酒酵母； 引物 JJJlS 为： 5'-GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTGA CCAGCTGAAGCTTCGTACG-3' ； 引物 JJJlA 为： 5'-AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTC GGCGTCGATTTTTGTGATG-3' 。 更进一步，所述酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) YJS329 (购自 CCTCC，编号为 CCTCC 2011275)。 本专利技术所述提高酿酒酵母菌株纤维乙醇发酵性能的方法按如下步骤进行： (I)JJJl基因敲除组件的获得 根据已报道的酿酒酵母JJJl基因（GenBank号：NC_001146. 8)和PUG6质粒 (GenBank号：AF298793. 1)的序列设计一对引物JJJlS和JJJ1A，以pUG6质粒为PCR模板， 扩增获得长度为2038bp的JJJl基因敲除组件（核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示）。 JJJlS 为： 5' -GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTG ACCAGCTGAAGCTTCGTACG-3'， JJJlA 为： 5' -AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTC GGCGTCGATTTTTGTGATG-3'。 (2)高纤维乙醇发酵性能菌株的构建 将 IO8 个酿酒酵母 YJS329 细胞，50 μ 1 鲑鱼精 DNA 溶液（2mg/ml)，240 μ 1 50 % (w/v)的PEG3350溶液，36 μ I I. OM醋酸锂溶液，步骤⑴获得的DNA片段25 μ 1混匀后于 30°C培养箱培养半小时，42°C水浴热击40min，12000rpm离心Imin去上清，沉淀用Iml YPD 液体培养基重悬，30°C培养2-3h后，吸取100 μ 1培养液涂布含300 μ g/ml遗传霉素 G418的 YH)平板上，30°C培养。挑取单菌落抽提基因组DNA，用PCR方法验证是否为阳性转化子。分 别以敲除验证引物和JJJl基因内部引物进行PCR反应，所述敲除验证引物为KS和AJJJl， JJJl基因内部引物为JJJl-S和JJJl-A ;电泳检测JJJl基因内部引物扩增无条带而敲除验 证引物扩增的条带为1555bp的，判断为JJJl基因缺失的酿酒酵母菌株； 引物 KS 为 5' -GATCGCGTATTTCGTCTCG-3' ； 引物 AJJJl 为 5' -TTACTTGACGGAGCGCATT-3' ； 引物 JJJl-S 为 5' -GAAGAACCAAGAGGGAAGT-3' ； 引物 JJJl-A 为 5, -TGTAAGCCCTTGTCTCCTA-3'。 所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)YJS329菌体细胞制备方法为：将酿 酒酵母YJS329菌落接种到IOml YPAD (10g/l酵母粉，20g/l蛋白粉，20g/l葡萄糖，80mg/l 腺嘌呤半硫酸，溶剂为去离子水，pH5. 5)液体培养基中，30°C条件下培养16h，吸取Iml培养 液到25ml的2XYPAD(20g/l酵母粉，40g/l蛋白粉，40g/l葡萄糖，160mg/l腺嘌呤半硫酸， 溶剂为去离子水，PH5. 5)培养液中继续培养2-3h，然后吸取Iml培养液离心，无菌水洗两遍 获得菌体细胞。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术方法可以高效地获得对 纤维素水解液抑制物耐性显著提升的酿酒酵母工程菌株，在多种抑制物（乙酸、糠醛、甲酸 和5-羟甲基糠醛）存在时乙醇发酵速率明显提高，发酵时间缩短20h以上。该专利技术方法获 得的酿酒酵母工程菌株更加适用于纤维素燃料乙醇发酵生产工艺。 四、【附图说明】： 图1为pUG6质粒图谱。 图2为JJJl基因敲除不意图。 图3为JJJl基因敲除组件和阳性转化子电泳验证图，泳道1为实施例1中引物 (JJJ1S和JJJ1A)获得的敲除组件DNA产物，泳道2为实施例2中引物（KS和AJJJ1)获得 的产物，泳道3为实施例2中引物（JJJ1-S和JJJ1-A)获得的产物。 图4菌株YJS329与菌株YJS △ JJJl对纤维素水解液中抑制物耐受性比较，a为菌 体浓度 3X 107cells/ml，b 为菌体浓度 3X 106cells/ml，c 为菌体浓度 3X 105cells/ml。 图5为菌株YJS329与菌株YJS Λ JJJl纤维乙醇发酵性能比较。 五、【具体实施方式】： 下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于 此： YPAD液体培养基组成：10g/l酵母粉，20g/l蛋白粉，20g/l葡萄糖，80mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高酿酒酵母菌株纤维乙醇发酵性能的方法，其特征在于所述方法是将酿酒酵母的JJJ1基因敲除。

【技术特征摘要】
1. 一种提高酿酒酵母菌株纤维乙醇发酵性能的方法，其特征在于所述方法是将酿酒酵 母的JJJ1基因敲除。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述JJJ1基因敲除是以PUG6载体质粒为模 板，在引物JJJ1S和引物JJJ1A的作用下进行PCR扩增，获得2038bp的DNA片段作为JJJ1 基因敲除组件，然后将JJJ1基因敲除组件转入酿酒酵母，即获得提高纤维乙醇发酵性能的 酿酒酵母； 引物JJJ1S为： 5'-...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑道琼，张珂，张黎杰，李欧，高克慧，方雅红，王品美，吴雪昌，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33