一种高效、低毒的石墨烯多功能载体的构建及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域。利用石墨烯易于进行各种功能化的特点，将小尺寸氧化石墨烯进行合理的多功能化，构建了一种高效、低毒的石墨烯多功能载体，可同时实现基因转染、生物活性分子输送、蛋白质纯化三种功能中的任意两种或两种以上功能。同时本发明专利技术也提供了该石墨烯多功能载体的详细制备步骤。本发明专利技术的主要用途为基因转染、活性分子输送、蛋白纯化等蛋白质作用机制的研究，可用于疾病发病机理的研究、药物设计以及基因治疗等领域。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物医药
。利用石墨烯易于进行各种功能化的特点，将小尺寸氧化石墨烯进行合理的多功能化，构建了一种高效、低毒的石墨烯多功能载体，可同时实现基因转染、生物活性分子输送、蛋白质纯化三种功能中的任意两种或两种以上功能。同时本专利技术也提供了该石墨烯多功能载体的详细制备步骤。本专利技术的主要用途为基因转染、活性分子输送、蛋白纯化等蛋白质作用机制的研究，可用于疾病发病机理的研究、药物设计以及基因治疗等领域。【专利说明】
： 本专利技术涉及一种高效、低毒的石墨烯多功能载体，集基因转染、生物活性分子输送 和蛋白质纯化功能于一体，可一步完成蛋白质作用机制的研究工作，提高了蛋白质作用机 制研究的效率和准确性。
技术介绍
： 石墨烯是由单层碳原子形成的二维平面型纳米材料，易于进行各种功能化，目前 已经广泛应用于生物化学领域。已有的研究证实，石墨烯可分别成功应用于药物运载、基因 转染、和蛋白质分离领域。 2008年，Hongjie Dai课题组报道了石墨烯用于小分子药物阿霉素 (doxorubicin)的负载，体外细胞实验获得良好的抗肿瘤活性，他们利用超支化聚乙二醇 (PEG)功能化的石墨烯细胞毒性非常小，说明石墨烯是一种良好的药物运载试剂。同年，陈 永胜课题组报道了氧化石墨烯对阿霉素可实现超高的负载率（2. 35mg mg-1)和可控释放。 2009至2011年间，张智军和陈永胜课题组分别报道了对石墨烯进行多功能化，采用不同方 法制备了多功能化石墨烯，用以负载药物并靶向肿瘤细胞，均取得良好效果。 2010年，刘遵峰在世界上首次提出将石墨烯应用于蛋白质纯化领域，可将蛋白质 (或复合物）进行快速亲和性分离。由于石墨烯具有极好的电子透射性能，无需进行洗脱， 可直接使用透射电镜进行单颗粒三维结构分析，从而使整个分离过程可快速完成。目前获 得对人类细胞中的航海蛋白（Navigator)的分离纯度可达到90%。2011年刘庄报道了石 墨烯可降低聚乙烯基亚胺（PEI)在基因转染过程中的毒性；张智军将石墨烯应用于DNA和 siRNA中的转染，获得低毒性和良好的效率。 本专利专利技术人在多年从事石墨烯的性质和生物化学中的应用研究过程中，利用 超小尺寸氧化石墨烯（<20nm)进行基因转染，获得高转染效率（90% )和相当低的毒性 (〈10%死亡率），远远高于经典商业化试剂lipofectamin(?30% )，在生物组织（斑马鱼 卵模型）中也显示出很好的性能。 通过上述背景资料可以看出，石墨烯在基因转染、生物活性分子输送、蛋白质纯化 领域中均表现出优异的性能。所以专利技术人认为，通过对石墨烯进行合理多功能化，完全有可 能将上述多种功能集石墨烯于一身。本专利技术即在以上技术背景之上，设计并制备发出集基 因转染、生物活性分子输送、和蛋白质纯化功能于一体的高效率、低毒性多功能载体，使蛋 白质作用机制的研究可一步完成，提高了蛋白质作用机制研究的效率和准确性。
技术实现思路
： 针对以上技术背景，提出本专利技术。 本专利技术的内容是提供一种研究蛋白质作用机制的高效率、低毒性的石墨烯多功能 载体的构建和制备方式，克服现有蛋白质研究工作流程繁复、效率低下、准确性难以保证等 不足，可同时完成基因转染、生物活性分子输送和蛋白质纯化的研究。 本专利技术涉及的石墨烯多功能载体示意图祥见说明书附图1。 本专利技术涉及的石墨烯多功能载体具有以下特性： 1.以超小尺寸氧化石墨烯（<20nm)为基本载体：超小尺寸氧化石墨烯（<20nm)尺 寸小，利于在细胞内运动，并易于进行功能化，且毒性小； 2.聚乙烯基亚胺（PEI)提供基因负载和转染能力，并提供反应性大量官能团 NH2 ； 3.多臂聚乙二醇增加载体的溶解性、生物相容性、延长载体活性成分在细胞内的 酶降解半衰期、并减小毒性； 4.链酶亲和素可专一性识别生物素标记的目标蛋白质，提供纯化功能。使用功能 性多肽（多肽1、2、3)利于载体跨越细胞内部屏障，提高转染效率； 5.牛血清蛋白可减少甚至消除非目标蛋白质的非专一性吸附，提高目标蛋白质纯 度。 本专利技术涉及的多功能载体的构建、合成步骤如说明书附图2。详细说明如下： 1.首先使用鳞片石墨（纯度99. 95% )，根据改进的Hummer's法制备氧化石墨烯。 然后超声分散于MilliQ水中，使用离心过滤膜（100Kd，Millip 〇re)过滤，使用MilliQ水洗 涤，得超小尺寸氧化石墨烯（尺寸小于20nm)。 2.将上述超小尺寸氧化石墨烯分散于MilliQ水中，加入超支化PEI (分子量： 25KD)和6臂聚乙二醇（单臂分子量：2000KD)，加入N-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐室温搅拌，使用离心过滤膜（l〇〇Kd，Millipore)过滤、MilliQ水洗涤，分散于 MilliQ水中即完成PEI和6臂PEG的功能化，得载体1。 3.将上步骤得到的载体1加入生物素、N-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐 酸盐（EDC)，室温搅拌过夜，使用离心过滤膜过滤，再用MilliQ水洗涤三次，分散于MilliQ 水（中。即完成生物素的功能化，得载体2。 4.将上步骤得到的载体2加入4-(N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥 珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC)，溶解在DMS0中，室温下反应2h。之后使用离心过滤膜过滤， 再用MilliQ水/ DMS0混合液洗涤三次，分散于PBS缓冲液中，得活化的载体2。活化的载 体2加入三羧乙基膦（TCEP)，搅拌、反应24h。使用离心过滤膜（lOOKd，Millipore)过滤， 再用PBS缓冲液洗涤三次，分散于PBS缓冲液中，即完成功能性多肽的功能化，得载体3。 5.将上步骤得到的载体3在2h内使用蠕动泵缓慢滴加到上述链酶亲和素与PBS 缓冲溶液中，然后过夜混合。使用离心过滤膜（l〇〇Kd，Millip〇re)过滤，再用PBS缓冲液洗 涤三次，分散于PBS缓冲液中，即完成链酶亲和素的功能化，得载体4。 6.将上步骤得到的载体4加入牛血清蛋白溶解于PBS缓冲液中，孵育lh，即完成 牛血清蛋白在该多功能载体上的物理吸附，得到最终多功能载体。 【专利附图】【附图说明】： 图1.集基因转染、生物活性分子运载和蛋白质纯化功能于一体的多功能石墨烯 载体的设计示意图 图2.集基因转染、生物活性分子运载和蛋白质纯化功能于一体的多功能石墨烯 载体合成步骤示意图。【权利要求】1. 一种用于研究蛋白质作用机制的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是可同时 实现基因转染、生物活性分子输送、蛋白质纯化三种功能中的任意两种或两种以上功能。2. 根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：以超小尺寸氧化 石墨烯为基本载体，超小尺寸的氧化石墨烯尺寸需小于500nm。3. 根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：使用高分子或阳 离子高分子提供基因负载和转染能力，并提供反应性大量官能团NH2。4. 根据权利要求3所述的阳离子高分子包含聚乙烯基亚胺（PEI)、聚酰胺-胺树形高 分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于研究蛋白质作用机制的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是可同时实现基因转染、生物活性分子输送、蛋白质纯化三种功能中的任意两种或两种以上功能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾凤美，刘遵峰，刘倩，
申请(专利权)人：常州碳宇纳米科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32