用于递送核酸的脂化的糖胺聚糖颗粒制造技术

提供了包含脂化的糖胺聚糖颗粒的组合物、用于制备其的方法以及其用于体内和体外有效递送核酸，诸如siRNA分子的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于递送核酸的脂化的糖胺聚糖颗粒 专利
本专利技术涉及包含脂化的糖胺聚糖颗粒（lipidatedglycosaminoglycan particle)(还称为gagomer)的组合物、用于制备其的方法以及其用于体内和体外有效递 送核酸，诸如siRNA分子的用途。 专利技术背景 核酸至期望的靶位点的有效递送一直是许多深入研究的重点。引入至靶位点后， 核酸可直接地或间接地在靶位点发挥生物效应。在一些情况下，核酸的递送可利用被设计 成递送核酸至靶位点的载体。可被递送至靶位点的示例性核酸包括脱氧核糖核苷酸核酸 (DNA)和核糖核苷酸核酸（RNA)，诸如，例如，siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA(AS-RNA)，等。 RNA干扰（RNAi)是基因沉默的内源细胞机制。RNAi通过以互补核苷酸序列通过 降解特定信使RNA(mRNA)或通过阻断mRNA翻译抑制特定基因的表达的双链RNA(dsRNA) 来进行。RNAi还可通过用病毒载体表达短发夹RNA(shRNA)，或通过并入合成的小干扰 RNA(siRNA)直接进入细胞质被外源性激活。siRNA是19-23个碱基对的化学合成的双链 RNA(dsRNA)，具有在5' -磷酸化末端和未磷酸化的3' -末端的2个未配对的核苷酸。在细 胞细胞质内，将siRNA并入RNA诱导沉默复合物（RISC)，该复合物分离RNA双链体的链并丢 弃有义链。然后反义RNA链引导RISC退火并切割靶mRNA或阻断其翻译。通过回收靶mRNA， 并入反义链的RISC复合物可显示在分裂细胞中长达几天以及在非分裂细胞中持续数周的 治疗效应。此外，siRNA的重复施用可导致其靶的稳定沉默。然而，尽管有这个希望，利用 siRNA作为疗法不是简单的任务。例如，由于分子量大（?13kDa)和净负电荷，裸的siRNA 分子藉以穿过质膜并进入细胞质的效率通常非常低。当静脉注射时，除了快速肾清除和对 由RNA酶降解的敏感性外，未经修饰的裸的siRNA被Toll样受体（TLR)识另I」。这常常刺激 免疫系统，并引发干扰素反应、补体激活、细胞因子诱导、及凝血级联反应（由PeerD.评 述）。除了不期望的免疫激活，这些效应可抑制基因全局表达，产生脱靶和误解的结果。 对于siRNA至细胞的体外或离体递送，通常使用常规的转染方法（由Weinstein 和Peer评述）。siRNA的体内递送可分为两类：局部的或全身性的。siRNA的局部递送已 在多种动物模型中被证明，并应用于几个正在进行的临床试验中。基于裸的或阳离子脂质/ 聚合物配制的siRNA的局部注射，该递送方法主要适用于粘膜病、皮下组织、眼内注射至眼 睛的玻璃体，等。siRNA的全身递送提供了另外的复杂性。由于细胞和局部递送处理siRNA 在细胞的细胞质中的内化、释放、和积累的需要，在整个动物中的全身递送执行另外的障碍 诸如，例如，siRNA与血液组分的相互作用（由于脂质体的正电荷与血清蛋白的通常负电荷 的静电相互作用，其是使用阳离子脂质体常见的并发症）、在毛细血管内的滞留、被网状内 皮细胞摄取、被RNA酶降解、解剖学屏障（诸如肝、脾和肾脏过滤）、免疫刺激、从血管渗出至 靶组织、在组织内的渗透，等。 多年来已建议了用于全身递送siRNA分子的各种方法和载体。方法和载体 包括siRNA的被动递送或siRNA的祀向递送。在本领域中描述的示例性载体包括： 稳定的核酸-脂质颗粒（SNALP)、中性脂质体、包含脂质体的1ipidoid、去端肽胶原 (atelocollagen)、胆固醇_siRNA、dynamicpolyconjugates、PEInanoplexs、抗体-鱼精蛋 白融合蛋白、适体siRNA、革巴向阳离子脂质体和包含聚阳离子的环糊精（⑶P)(由Manjunath 和Dykxhoorn;以及Weinstein和Peer?评述）。 本领域中所描述的一些siRNA载体利用可被作用颗粒的组分和/或作为靶向部分 的透明质酸。例如：Taetz等人的出版物涉及用于抗端粒酶siRNA至表达⑶44的肺癌细胞 的靶向递送的透明质酸修饰的D0TAP/D0PE脂质体。Lee.等人的出版物涉及使用可降解的 透明质酸纳米凝胶，siRNA的靶特异性细胞内递送。Choi等人的出版物涉及用于靶向活性 肿瘤的自组装的透明质酸纳米颗粒。Peer等人的出版物涉及全身白细胞定向siRNA递送， 揭示细胞周期蛋白D1作为抗炎靶点。例如，PCT专利申请公布号W0 2011/013130涉及包 含多核苷酸试剂的靶向细胞的纳米颗粒及其用途。此外，美国专利7, 544, 374涉及脂化的 糖胺聚糖颗粒以及其在用于诊断和治疗的药物和基因递送中的用途。 然而，本领域中描述的载体，包括利用透明质酸的载体，没有解决与成功递送，并 且特别是体内递送siRNA至其靶细胞相关的所有障碍。 因此，本领域中存在对用于有效并特定递送SiRNA进入期望的靶位点的改进的载 体组合物的需要，其中载体组合物是稳定的、具有长的保质期、可生物降解的、适合于工业 生产过程、具有高包封能力、无毒、避免诱导免疫应答、对包封于其中的siRNA提供增强的 保护（稳定性和完整性），并且能够有效地体外和体内递送siRNA至其靶位点，使得siRNA 能够有效地发挥期望的效应。 概述 根据一些实施方案，提供了被用作核酸分子，诸如，例如，SiRNA分子的体内和体外 有效的并有效率的递送系统的改进的脂化的糖胺聚糖组合物（Gagomer)。 根据一些实施方案，本专利技术至少部分地依赖于以下的令人惊奇和意外的发现：在 用于制备脂化的糖胺聚糖颗粒的脂质的组合物中的修饰、在其制备的方法中的修饰、在Gagomer的各种组分之间的比率以及Gagomer颗粒的各种组分之间的缔合和其中包封的核 酸分子（诸如，例如，siRNA分子）的修饰，意外地提供了通常作为用于体外和体内两者应 用的核酸分子并且特别是siRNA分子的递送系统是非常有用的增强的Gagomer组合物。相 比于在先前描述的Gagomer组合物，本专利技术的增强的Gagomer组合物显示了各种改进。例 如，本专利技术的增强的Gagomer组合物显示了改进的稳定性（保质期），确定的结构和均匀尺 寸分布和电荷。此外，本专利技术的增强的Gagomer组合物适合于有成本效益的工业生产工艺， 并且还可通过常规消毒方法进行消毒。此外，本专利技术的增强的Gagomer组合物显示了包封 核酸分子的高效率以及高载量能力（即，Gagomer可有效地负载核酸的数/量）。另外，本 专利技术的增强的Gagomer组合物能够对包封在Gagomer颗粒内的核酸分子提供增强的保护。 此外，本专利技术的增强的Gagomer组合物对细胞无免疫毒性也不会在分离的人外周血单核细 胞（PBMC)中引起免疫应答，并基于体内施用。本专利技术的Gagomer组合物的增强的性能是用 于核酸的有效的、无毒的并有用的递送系统的关键参数。 此外，在另一个意外的发现中，本专利技术的增强的Gagomer组合物显示了在Gagomer 颗粒的脂质组分和包封于其中的核酸（诸如，例如，siRNA)之间的意外的重量比。例如，更 高的脂质对siRNA的重量比提供了siRNA对其靶点的改进的生物效应。此外，如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，所述组合物包括包含形成颗粒脂质组合物的多个脂质的水不溶性脂化糖胺聚糖颗粒和包封于所述颗粒内的核酸，其中所述核酸与脂质的重量比小于1:1。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.18 US 61/625,7201. 一种组合物，所述组合物包括包含形成颗粒脂质组合物的多个脂质的水不溶性脂化 糖胺聚糖颗粒和包封于所述颗粒内的核酸，其中所述核酸与脂质的重量比小于1:1。2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述多个脂质包括阳离子脂质和具有伯氨基基团 的脂质。3. 如权利要求2所述的组合物，其中所述阳离子脂质选自：单阳 离子脂质N-[l-(2,3-二油酰氧基）]-N，N，N-三甲基铵丙烷（DOTAP)、 BCAT (〇- (2R-12-双-〇- (I ' Z, 9' Z-十八碳二稀基）-甘油）-3-N-(二 _2_ 氛乙基）-氛基 甲酸酯）、BGSC (双-胍盐-亚精胺-胆固醇）、BGTC (双-胍盐-三氨乙基胺-胆固醇）、 CDAN(N'_胆固醇基氧羰基-3, 7-二氮杂壬烷-1，9-二胺）、CHDTAEA(胆固醇基半二硫代二 甘醇基三（氨（乙基）胺）、DCAT(0-(1，2-二-0-(9'2-十八碳烯基）-甘油）-34-(双-2-氨 乙基）-氨基甲酸酯）、〇〇〇 1〇1(30-[^(^，^-二甲基氨（乙基）氨基甲酰基胆固醇）、 DLKD (0, 0'-二月桂基N-赖氨酰天冬氨酸酯）、DMKD (0, 0'-二肉豆蘧基N-赖氨酰天冬氨酸 酯）、D0G (二油基甘油、DOGS (二（十八碳烯基）酰氨基甘氨酰基精胺）、D0GSDS0 (1，2-二油 酰基-sn-甘油-3-琥珀酰基-2-羟乙基二硫鸟氨酸）、D0PC (1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷 酸胆碱）、D0PE (1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、D0SN(二油基琥珀酰乙基硫代新 霉素）、D0SP (二油基琥珀酰巴龙霉素 ）、DOST (二油基琥珀酰妥布霉素）、D0TAP (1，2-二油 酰基-3-三甲基铵丙烷）、DPPES (二棕榈酰磷脂酰乙醇酰氨基精胺）、DDAB和D0DAP。4. 如权利要求2所述的组合物，其中所述具有伯氨基基团的脂质选自：1，2-二月桂 酰基-L-磷脂酰乙醇胺（DLPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、1，2-二 植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPhPE)、1，3-二棕榈酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺 (1，3-DPPE)、1-棕榈酰基-3-油酰基-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺（1，3-P0PE)、生物素-磷脂 酰乙醇胺、1，2-二肉豆蘧酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DMPE)、和二棕榈酰基磷脂酰乙醇 胺（DPPE)。5. 如权利要求2所述的组合物，其中所述多个脂质还包括膜稳定化脂质。6. 如权利要求5所述的组合物，其中所述膜稳定化脂质选自：胆固醇、磷脂、脑磷脂、鞘 月旨、和甘油糖脂。7. 如权利要求1所述的组合物，其中所述糖胺聚糖选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮 肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、其盐、及混合物。8. 如权利要求7所述的组合物，其中所述透明质酸包括高分子量透明质酸。9. 如权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒脂质组合物具有10_200nm的粒径。10. 如权利要求1所述的组合物，其中所述核酸包括DNA、RNA、其修饰形式、及其组合。11. 如权利要求10所述的组合物，其中所述RNA选自811?嫩、11^嫩、8111^、反义1^及 其组合。12. 如权利要求1所述的组合物，其中所述多个脂质和所述核酸之间的重量比是10:1。13. 如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包括靶向部分。14. 如权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒适合于递送所述核酸至靶位点。15. 如权利要求1所述的组合物，其中所述靶位点选自细胞、组织、器官、以及微生物。16. 如权利要求1所述的组合物，所述组合物包括包含单阳离子脂质N-[l-(2, 3-二油 酰氧基）]-N，N，N-三甲基铵丙烷（D0TAP)的阳离子脂质、包含1，2_二月桂酰基-L-磷脂 酰乙醇胺（DLPE)的具有伯氨基基团的脂质、以及包含胆固醇的膜稳定化脂质。17. 以冷冻干燥的颗粒的形式的根据权利要求1-16的任一项的组合物。18. -种药物组合物，所述药物组合物包含以适合于经由选自口服、肠胃外和局部的途 径施用的剂型的根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹·培尔，伊芙吉尼娅·阿尔佩特，
申请(专利权)人：雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司，奎尔特治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL