玉米磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的克隆及应用制造技术

玉米磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的克隆及应用属分子生物学和生物技术领域，本发明专利技术提供的耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白，由ZmSEC14p基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；一种植物表达载体，含有耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p；构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过低温和冷冻胁迫后观测转基因拟南芥的表型、存活率等生命状态；实验结果表明：本发明专利技术的耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p可提高拟南芥的抗冷性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和生物
，具体涉及一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的克隆及应用。
技术介绍
作物经常会受到各种各样的非生物胁迫，例如干旱、盐、低温等，严重制约了作物的种植区域，甚至导致产量下降[1]。低温影响种子的萌发、幼苗的生长以及农业产量。为了抵抗或适应逆境，植物体感受外界环境的变化并将信号通过多种途径传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受低温胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号与调控基因表达的转录因子。许多响应低温的基因已被报道，比如COR(低温调控)，KIN(低温诱导)，RD(响应脱水)基因[2、3、4]。三个熟知的CBFs转录因子在激活COR/KIN/LTI/RD基因的转录中扮演着重要的角色。过表达CBF/DREB1基因能提高转基因植株的抗逆性，或者提高逆境响应基因(COR15A,KIN1,RD29B)的表达。水稻OsP5CS2基因，一个脯氨酸生物合成酶，被证明对植物抗盐和抗低温是必要的。因此，鉴定抗冷相关基因对丰富低温代谢途径具有重要的意义。玉米是世界产量最大、种植范围最广的禾谷类作物，居三大粮食作物之首。起源于亚热带地区，为低温敏感作物。但是由于地理条件原因，东北春季经常遭受低温冷害的侵袭，造成大面积的减产，尤其在严重低温冷害年，玉米减产可达20％以上，品质也随之下降。在此情况下，鉴定冷响应相关基因对培育抗冷玉米新种质新品种具有重要的经济价值。SEC14p是一类磷脂酰肌醇转运蛋白，在体外具有磷脂酰肌醇与磷脂酰胆碱转移活性，同时广泛存在于真核细胞中[5、6、7]。其功能参与必要的生物学过程，比如磷脂代谢，细胞膜运动，细胞膜极性生长，信号转导以及逆境响应[8]。许多报道发现磷脂酰肌醇转运蛋白参与非生物胁迫。高粱在氮胁迫下转录组分析表明：高丰度的磷脂酰肌醇转运蛋白能够提高对氮胁迫的抗逆性。Jeongyeo Lee报道低温胁迫下，SEC14细胞质因子家族蛋白在抗冷卷心菜中的表达更高[9]。尽管这些证据表明磷脂酰肌醇转运蛋白受逆境的诱导，但还未见利用这些生物逆境相关基因提高植物抗冷性的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：(1)提供一种DNA序列，其是在耐冷玉米自交系W9816中克隆得到的编码磷脂酰肌醇转运蛋白的基因，命名为ZmSEC14p；(2)提供玉米磷脂酰肌醇转运蛋白的基因ZmSEC14p在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。在下文中将详细描述本专利技术。(一)本专利技术提供了一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。将课题组自行培育的耐冷玉米自交系W9816培育至三叶期，于人工气候箱中低温(4℃)处理12h，采集叶片用于RNA的提取。根据cDNA-AFLP获得的候选基因片段，设计3’端、5’端巢式引物，利用RACE方法进行3’端、5’端扩增，将所得的PCR产物与PMD18-T载体连接，转化Top10大肠杆菌感受态，筛选重组子，并进行测序。测序结果经分析可拼接成完整的cDNA。根据拼接结果，设计特异性引物，获得耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p预期完整的cDNA全长序列。耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p全长为1346bp，包括888bp的开放阅读框，251bp的5’UTR和207bp的3’UTR区，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，如SEQ ID NO:1所示。(二)本专利技术提供了一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白，由耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白由295个氨基酸组成，此蛋白包含保守的SEC14蛋白家族结构域(86-241aa)，N端包含CRAL-TRIO-N结构域(19-65aa)。与水稻(NP_001051120.1)，拟南芥(NP_195382.1)，大麦(MLOC_67500.1)，大豆(XP_003544415.1)，谷子(XP_004981935.1)，高粱(Sb01g009685.1)，小麦(EMS66889.1)和葡萄(XP_002266907.2)的氨基酸多重序列比较表明，这些蛋白在保守的SEC14结构域同源性很高。系统进化树分析表明，此蛋白与水稻亲缘关系最近，与拟南芥、酵母的亲缘关系较远。(三)本专利技术提供了一种植物表达载体，其含有耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p。根据ZmSEC14p基因的CDS序列及中间载体pCHF3300多克隆位点的相关信息，设计引物时加入相应酶切位点以扩增ZmSEC14p基因。将经测序验证的、准确的ZmSEC14p基因用相应的限制性内切酶酶切，回收小片段(基因)。同时将表达载体pCAMBIA3301以相同限制性内切酶酶切，回收大片段(载体)。用DNA连接酶将回收的大、小片段连接，重组为ZmSEC14p基因的植物表达载体。之后将重组载体转化大肠杆菌、提取质粒进行PCR和酶切鉴定。(四)本专利技术提供了耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。利用蘸花法将含有ZmSEC14p基因的植物表达载体导入拟南芥，多代经Basta筛选及分子鉴定，获得T3代拟南芥转基因植株。对纯合的T3代转基因拟南芥植株进行抗逆性分析，结果表明，过表达植株耐冷及抗冻性显著高于野生型。本专利技术的有益效果在于提供了一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的核苷酸序列及氨基酸序列，构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过低温和冷冻胁迫后观测转基因拟南芥的表型、存活率等生命状态，结果表明玉米磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p可提高拟南芥的抗冷性。附图说明图1为玉米ZmSEC14p与其他植物SEC14p氨基酸的多重序列比较图其中：NP_001051120.1为水稻；MLOC_67500.1为大麦；XP_003544415.1为大豆；XP_004981935.1为谷子；Sb01g009685.1为高粱；EMS66889.1为小麦；XP_002266907.2为葡萄。图2为玉米ZmSEC14基因的系统进化树分析示意图其中：NP_001051120.1为水稻；MLOC_67500.1为大麦；XP_003544415.1为大豆；XP_004981935.1为谷子；Sb01g009685.1为高粱；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p，其特征在于其核
苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白，其特征在于由权利要求1所述的
耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p序列编码，其氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：原亚萍，王晓宇，单晓辉，苏胜忠，吴颖，李世鹏，刘宏魁，韩俊友，薛春梅，王帅，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22