对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术描述了以高亲和力结合GPC3或GPC3上硫酸类肝素（HS）链的人单克隆抗体的鉴定。本发明专利技术描述的抗体能够抑制HCC细胞生长和迁移。提供了对GPC3或GPC3上HS链特异的人单克隆抗体，包括免疫球蛋白分子例如IgG抗体以及抗体片段例如单结构域VH抗体或单链可变区片段（scFv）。还提供了包含结合GPC3或GPC3上HS链的抗体的组合物、编码这些抗体的核酸分子、包含所述核酸的表达载体和表达所述核酸的分离的宿主细胞。还提供了治疗癌症和/或抑制肿瘤生长或转移的方法。还提供了检测受试者中的癌症以及确认受试者的癌症的诊断的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2011年4月19日提交的美国临时申请N0.61/477，020的权益，该临时申请以引用的方式全文纳入本文。
本公开内容涉及对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)或GPC3上的硫酸类肝素特异的抗体以及它们用于治疗癌症的用途。
技术介绍
肝癌在世界上最流行的肿瘤中位居第五并且在癌症相关死亡的最常见原因中位居第三(Bosch et al.，Gastroenterologyl27: S5-S16, 2004 ;El_Serag et al., Gastroenterologyl32:2557-76, 2007)。根据美国癌症学会，肝细胞癌(HCC)占肝癌病例的约75%。往往直到晚期肝癌才会有症状。外科手术是肝癌的标准治疗，因为这种类型的癌症对大多数的化疗药物反应不好。因此，迫切需要开发具有不同作用机制的新药物。免疫治疗代表一种新方法，但是其仍然是一个挑战，这主要是因为没有良好的肿瘤特异性靶位。硫酸类肝素蛋白聚糖中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族通过与糖基磷脂酰肌醇(GPI)共价连接而锚定到细胞表面。在脊椎动物中，已经鉴定了六个家族成员(GPC1-6)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白能够改变细胞信号通路并且促进细胞增殖和组织生长。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)在HCC和一些其他的人癌症包括黑色素瘤、肺的鳞状细胞癌和卵巢的透明细胞癌中高表达，但是在正常的组织中不表达(Ho和Kim, Eur J Cancer47 (3):333-338, 2011)。GPC3基因编码70kDa的前体核心蛋白，所述前体核心蛋白可被弗林蛋白酶切割产生40kDa的氨基(N)端片段和30kDa的膜结合羧基(C)端片段。所述C端具有两个硫酸肝素(HS)聚糖链。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇锚连接到细胞膜。GPC3结合Wnt和Hedgehog信号蛋白(Capurro et al., Dev Cel114:700-711, 2008 ；Capurro et al., CancerRes65:6245-6254, 2005)，并且还能够通过其HS聚糖链结合碱性生长因子例如成纤维细胞生长因子 2 (Song et al., J Biol hCem272:7574-7577，1997)。GPC3的功能丧失型突变引起过度生长综合症(Simpson-Golab1-Behmelsyndrome)-一种罕见的伴X染色体的过度生长疾病(Pilia et al., NatGenetl2:241-247, 1996)。GPC3 缺陷的小鼠具有类似的症状(Cano-Gauci et al., J CellBiol 146:255-264，1999)。在转基因小鼠中，过表达GPC3可抑制肝细胞增殖和肝再生(Liuet al.，Hepatology52 (3): 1060-1067，2010)。另外,Zittermann 等人最近指出，用慢病毒感染的表达可溶性GPC3 (sGPC3)的HCC细胞具有更低的细胞增殖速率(Zittermann etal.，Int J Cancerl26:1291-1301, 2010)。这一发现可能暗示由感染的细胞分泌的sGPC3蛋白以自分泌的方式抑制细胞增殖。新近一项在人HEK-293细胞中使用没有GP1-锚定结构域的重组sGPC3 (GPC3AGPI，氨基酸残基Q25-H559)的研究提供了 sGPC3蛋白可在体外抑制 HCC 生长的直接证据(Feng et al., Int J Cancerl28 (9): 2246-2247，2011 )。然而，GPC3的确切生物功能和其在肿瘤发生中的作用仍是未知的。HS蛋白聚糖(HSPG)是关键的分子效应物并且由于它们能够与许多重要的分子相互作用而在癌症和血管发生中具有多种功能。HSPG的大部分蛋白结合活性归功于HS链(Kim et al., J Endocrinol209 (2): 139-151，2011)。平均 HS 链的长度为 50-200 个重复的二糖单元。肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因，但是对肿瘤转移的分子机制仍然知之甚少。已经广泛接受的是，蛋白酶例如基质金属蛋白酶的蛋白水解活性可促进癌症转移。最近，新出现的证据显示，癌症转移还伴随有能够切割HS蛋白聚糖的HS侧链的酶(例如类肝素酶)的活性(Arvatz et al., Cancer Metastasis Rev30 (2): 253-268，2011 )。
技术实现思路
本文提供了结合例如特异性结合GPC3或GPC3上HS链的人单克隆抗体。所提供的抗体包括免疫球蛋白分子例如IgG抗体以及抗体片段例如单结构域VH抗体或单链可变区片段(scFv)。还提供了包括结合例如特异性结合GPC3或GPC3上HS链的抗体的组合物、编码这些抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体以及表达所述核酸分子的分离的宿主细胞。还提供了包含本文公开的抗体和效应分子例如毒素的免疫缀合物。本文提供的抗体和组合物可用于多种目的，例如用于在受试者中确认表达GPC3的癌症例如HCC的诊断。因此，本文提供了一种确认受试者中癌症的诊断的方法:使来自被诊断患有癌症的受试者的样品与结合GPC3或GPC3上HS链的人单克隆抗体接触；并检测所述抗体与所述样品的结合。相对于所述抗体与对照样品的结合，所述抗体与所述样品的结合增加确认了所述癌症诊断。在一些实施方案中，所述方法还包括使特异性识别所述GPC3特异性抗体的第二抗体与所述样品接触并检测所述第二抗体的结合。类似地，本文提供了一种在受试者中检测表达GPC3的癌症例如HCC的方法，其包括使来自所述受试者的样品与本文描述的人单克隆抗体接触；并检测所述抗体与所述样品的结合。相对于对照样品，所述·抗体与所述样品的结合增加检测出所述受试者中的癌症。在一些实施方案中，所述方法还包括使特异性识别所述GPC3特异性抗体的第二抗体与所述样品接触，并且检测所述第二抗体的结合。还提供了一种治疗患有癌症例如HCC的受试者的方法:选出患有表达GPC3的癌症的受试者，给予所述受试者治疗有效量的对GPC3或GPC3上HS链特异的单克隆抗体，或包含所述抗体的免疫缀合物。在其他实施方案中，通过如下治疗或诊断所述癌症:给予包括SEQ ID N0:2的氨基酸残基26-33、51-57和96-105的单克隆抗体；或者给予包括SEQ ID NO: 14的氨基酸残基26-33、51-58 和 97-105 以及 SEQ ID NO: 16 或 SEQ ID NO: 31 的残基 27_32、50_52 和 89-97的单克隆抗体。在具体实施方案中，提供了一种抑制受试者中肿瘤生长或转移的方法:选出患有表达GPC3的癌症的受试者，给予所述受试者治疗有效量的本文公开的组合物。从以下参照附图进行的详细描述中，本专利技术上述的和其他目的、特征以及优点会变得更加清楚。【附图说明】图1A和IB示出了重组GPC3蛋白的产生。(A)野生型GPC3蛋白和没有HS链的突变型GPC3的SDS-PAGE。(B)蛋白质印迹分析。Wt=野生型sGPC3_hFc ；mu=没有HS链的突变型 sGPC3 (AA) -hFc。图2示出了克隆HN3VH与来自公开数据库的已知人V本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ?ID?NO:2的氨基酸残基26?33、SEQ?ID?NO:2的氨基酸残基51?57和SEQ?ID?NO:2的氨基酸残基96?105。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.19 US 61/477,0201.一种结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基26-33、SEQ ID NO:2的氨基酸残基51-57和SEQ IDNO: 2的氨基酸残基96-105。2.权利要求1的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:2的氨基酸序列。3.一种结合GPC3上硫酸类肝素(HS)的分离的人单克隆抗体，其中: (i)所述抗体的重链包含SEQID N0:14的氨基酸残基26-33、SEQ ID NO: 14的氨基酸残基51-58和SEQ ID NO: 14的氨基酸残基97-105 ； (ii)所述抗体的轻链包含SEQID NO: 16或SEQ ID NO:31的氨基酸残基27-32、SEQID NO: 16 或 SEQ ID NO:31 的氨基酸残基 50-52 和 SEQ ID NO: 16 或 SEQ ID NO:31 的氨基酸残基89-97 ;或(iii)(i)和 Qi)。4.权利要求3的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO: 14的氨基酸残基26-33、51-58和97-105，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 16的氨基酸残基27_32、50_52和89-97。5.权利要求3的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO: 14的氨基酸残基26-33、51-58和97-105，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 31的氨基酸残基27_32、50_52和89-97。6.权利要求3-5任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO: 14的氨基酸序列。·7.权利要求3-5任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO: 16或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。8.权利要求1-7任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体为VH单结构域抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’ 2片段、单链可变区片段(scFv)或二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)。9.权利要求8的人单克隆抗体，其中所述抗体为VH单结构域抗体。10.权利要求8的人单克隆抗体，其中所述抗体为scFv。11.权利要求1-7任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体为IgG。12.权利要求1-11任一项的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体被标记。13.权利要求12的分离的人单克隆抗体，其中所述标记为荧光标记、酶标记或放射性 T 己 O14.一种组合物，其包含可药用载体中的治疗有效量的权利要求1-13任一项的抗体。15.一种分离的免疫缀合物，其包含权利要求1-13任一项的人单克隆抗体和效应分子。16.权利要求15的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为毒素。17.权利要求16的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为假单胞菌(Pseudomonas)外毒素或其变体。18.权利要求17的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为包含SEQID NO: 27的氨基酸序列的PE38。19.权利要求16-18任一项的分离的免疫缀合物，其中所述人单克隆抗体为包含SEQID NO: 2的氨基酸残基26-33、51-57和96-105的VH单结构域抗体。20.权利要求19的分离的免疫缀合物，包含SEQID NO:29的氨基酸序列。21.权利要求15的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为可检测标记。22.—种组合物，其包含可药用载体中的治疗有效量的权利要求15-21任一项的分离的免疫缀合物。23.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括选择患有表达GPC3的癌症的受试者并给予所述受试者治疗有效量的权利要求14或权利要求22的组合物，从而治疗所述受试者的癌症。24.一种抑制肿瘤生长或转移的方法，其包括选择患有表达GPC3的癌症的受试者并给予所述受试者治疗有效量的权利要求14或权利要求22的组合物，从而抑制肿瘤生长或转移。25.—种确定受:试者是否患有癌症的方法，其包括: 使来自所述受试者的样品与权利要求1-13任一项的人单克隆抗体接触；和 检测所述抗体与所述样品的结合， 其中与所述抗体和对照样品的结合相比，所述抗体与所述样品的结合增加可鉴定所述受试者...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·何，丰明乾，W·高，金兴男，D·S·迪米特洛夫，
申请(专利权)人：美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，
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