本发明专利技术涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段，其具有如SEQ ID No.1的氨基酸序列；本发明专利技术的GPC3蛋白片段的抗体特异性强，可用于制备高效价的多克隆或单克隆抗体，或者制备GPC3蛋白标准品，可用于GPC3蛋白检测，包括蛋白含量、活性和蛋白结构的检测。本发明专利技术还涉及一种单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5，分泌的GPC3抗体产量高，效价高，反应灵敏，有利于提高检测的灵敏性和准确性，可以广泛应用于GPC3蛋白表达的检测，降低GPC3抗体的生产成本，有利于GPC3检测的临床推广使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3蛋白片段、其应用及其制备的单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5，具体属于细胞工程领域。
技术介绍
我国肝癌的早期诊断中应用最多的检测指标是甲胎蛋白(AFP)，吴孟超等检测了5343例肝癌病例中甲胎蛋白的水平，阳性率为69.4%。表明甲胎蛋白是目前诊断肝癌极为重要的血清标志物之一，但是同时仍有3成以上的错、漏检率。寻找新的肝癌特异性标志物是提高临床早期诊断的重要途径之一。磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一个家族，参与调控个体发育、细胞增殖和分化等过程。其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是1996年Pillia等在研宄Simpson-Golab1-Behmel综合症(SGBS)时，从人胚胎cDNA文库中首次克隆。GPC3基因定位于人染色体Xq26，结构全长大于900kb，是人类最大的基因之一。其5’端朝向端粒区，3’端朝向中心粒区，由8个外显子和7个内含子组成。启动子区有许多转录因子结合位点。cDNA序列全长为2263bp，1740bp的开放阅读框编码580个氨基酸，分子量为66KDa左右。Glypican-3的结构具有Glypican家族的共同特点，如中央球状空间结构、C端通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol, GPI)销定于细胞膜上等。近期的相关研宄表明，Glypican-3与多种肿瘤的发生发展关系密切，特别是在肝细胞癌中特异性高表达，是一种潜在的肝癌血清学和组织学重要诊断标志物。专利CN200880103166.9公开了一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体，其是以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的胞外域制备的单克隆抗体，用于肿瘤诊断药物。专利CN201210152819.0则公开了一种以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3全长片段制备的单克隆抗体，用于肿瘤诊断药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于表达出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白片段，同时提供一种所分泌抗体的效价高、特异性强的单克隆抗体杂交瘤细胞株，有利于提高检测的反应灵敏性。本专利技术为实现上述专利技术目的，所采用的技术方案如下:一种具有如SEQ ID N0.1的氨基酸序列的磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段。进一步的，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段由SEQ ID N0.2的cDNA序列编码。进一步的，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段的cDNA序列通过PCR扩增获得，所述 PCR 的上游引物为 SEQ ID N0.3:5’ -0MMieCTTGGTGGTGGCGATGCT-3’，下游引物为 SEQ ID N0.4:5’ -CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3’。进一步的，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段的表达载体为P3XFLAG-CMV-14，表达质粒为 CMV_gpc3。所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段在制备癌症检测制剂中的应用。进一步的，所述的癌症检测制剂包括以GPC3为标记物的检测制剂、含GPC3多克隆抗体的检测制剂或含GPC3单克隆抗体的检测制剂。分泌所述的GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5，该细胞株于2014年11月28日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号为:CCTCC C2014211。所述的分泌GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备以GPC3重组蛋白为抗原免疫小鼠，取血清效价在1:1O5以上的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，筛选获得杂交瘤细胞株GPC3-1H5 ;所述GPC3重组蛋白具有如SEQ ID N0.1的氨基酸序列。单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备方法中所述GPC3重组蛋白由SEQ IDN0.2的cDNA序列编码；所述cDNA序列通过PCR扩增获得，所述PCR的上游引物为SEQ IDN0.3:5’ -CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3’，下游引物为 SEQ ID N0.4:5’ -CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3’。单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备方法中所述GPC3重组蛋白的表达载体为 p3XFLAG-CMV-14，表达质粒为 CMV_gpc3。单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5分泌的单克隆抗体在制备GPC3蛋白表达检测试剂盒中的应用。磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段在制备癌症检测制剂中的应用，其特征在于所述的癌症检测制剂包括以GPC3为标记物的检测制剂、含GPC3多克隆抗体的检测制剂或含GPC3单克隆抗体的检测制剂。本专利技术单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5分泌的单克隆抗体可以应用于制备检测试剂盒，用于检测GPC3蛋白表达，如ELISA检测、免疫荧光分析、western-blot、免疫组织化学检测等。本专利技术的有益效果为: 本专利技术的GPC3蛋白片段的抗体特异性强，可用于制备高效价的多克隆或单克隆抗体，或者制备GPC3蛋白标准品，可用于GPC3蛋白检测、包括含量、活性和蛋白结构的检测。本专利技术的单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5分泌的抗体产量高，效价高，反应灵敏，有利于提高检测的灵敏性和准确性，可以广泛应用于GPC3蛋白表达的检测，降低GPC3抗体的生产成本，有利于GPC3检测的临床推广使用。生物样品保藏信息 单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5，分类命名为细胞株(CW7 Strain),已于2014年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址:武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072，菌种保藏号为CCTCC N0.C2014211。【附图说明】图1为实施例1中gpdi基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图； 图2为实施例1中重组质粒的EcoR I和BamH I双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；图3为GPC3真核表达后的SDS-PAGE电泳图。【具体实施方式】本专利技术结合附图和具体实施例做进一步的说明。实施例1斯⑴基因的克隆及重组表达质粒的构建以含gpdi基因的质粒为模板进行PCR扩增。上游引物:5’-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3’，插入 EcoR I 酶切位点。下游引物:5’ -CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3 ’，插入 BamH I 酶切位点。扩增条件:95°C预变性5 min ;94°C变性 I min，62°C退火 I min，72°C延伸 2 min，共30个循环；72°C延伸10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段，其特征在于其具有如SEQ ID No.1的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程华，闫静辉，方向东，吴萌，崔硕，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。