海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3，其单糖组分含有甘露糖：葡萄糖胺：葡萄糖醛酸：乙酰氨基半乳糖：半乳糖：岩藻糖的质量比例为1:1.5:0.92:3:1.8:2；该海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的分子量为10kDa至16kDa，硫酸基团的含量为10%至14%之间。本发明专利技术还提供了一种相应的提取方法，与现有技术相比，本发明专利技术的优点在于：提取、纯化工艺较简单，提取纯度好、易于操作，增加脾脏指数、造血功能活性显著，安全无毒，对不良反应有抑制作用。

【技术实现步骤摘要】
海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3及其制备方法
本专利技术涉及一种从乌贼墨中提取分离纯化的具有新颖结构的胺聚糖及其提取方法，尤其涉及一种海洋硫酸酯化糖胺聚糖及其制备方法。
技术介绍
随着复杂的生物学功能被不断揭示，多糖在免疫调节、抗凝血、抗肿瘤和调节血脂等方面得到了应用。海洋生物处于高盐、高压寡营养等独特的环境中，使得很多海洋来源的多糖具有独特的结构和生物功能，使得开发海洋多糖资源成为目前海洋药物学是研究的一大热点。对海洋生物多糖研究比较多的集中在了海洋藻类多糖，目前随着资源的进一步开发，海洋动物来源的多糖也越来也受到关注。鲍鱼中含有硫酸化杂多糖，由半乳糖(Gal )、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、岩藻糖(Fuc)和葡萄糖醛酸(GlcUA)组成，含有11%左右的硫酸基，在免疫调节、抗肿瘤、改善记忆、抗凝血和抗炎等方面均具有显著的活性。海参中富含由乙酰氨基半乳糖(Gal-NAc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)和岩藻糖(Fuc)组成的粘多糖和硫酸酯化的岩藻聚糖对神经元的保护作用和心血管疾病方面均具有保护作用。乌贼又称墨鱼，海洋软体动物，属头足类。广泛分布于我国沿海，尤以浙江省产量最高，是舟山市的四大经济海产之一，乌贼墨是乌贼科动物墨囊内提取物质，因其颜色和来源而得名。由细小黑色颗粒构成的粘稠状的混悬液，蛋白多糖复合物，含有多种活性成分，具有较高药用价值。通常乌贼墨会作为废弃物被扔掉，自从日本学者发现其抗肿瘤活性后，乌贼墨的研究逐渐与日俱增，很多日本食品企业也开始将乌贼墨用于食品中。研究表明，蛋白多糖复合物是 乌贼墨重要的活性成分，也是海洋特征寡糖的一大来源。对乌贼墨来源的海洋多糖的研究将有助于进一步利用乌贼产品加工的废弃物，变废为宝，为海洋多糖糖在医药等领域的利用提供物质基础，提高了乌贼的应用价值和产值。乌贼墨是乌贼加工过程中的废弃物，研究表明新鲜乌贼墨中含有水分、色素、蛋白质、脂肪、糖类等物质。乌贼墨也可作为一种中药，文献上早有记载。《本草拾遗》中有:“腹中墨,主治血刺心痛”。在《本经》中有记载:“可收敛止血，固精止带，制酸定痛，除湿敛疮”。乌贼墨制剂临床上主要作为止血剂，治疗出血性疾病如:功能性子宫出血、胃出血等。中国海洋药物辞典也收录了乌贼墨。20世纪90年代，日本青森产业技术中心和弘前大学发现乌贼墨具有抗肿瘤作用，并从中提取得到一种具有高效抗癌活性的多糖一蛋白复合体，掀起了开发乌贼墨生物功能的热潮，目前在日本主要是作为一种保健食品。近年来国内外对乌贼墨进行了一系列研究和开发，研究表明乌贼墨具有止血、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射等多种生理活性，特别是对乌贼墨多糖的提取纯化、结构及生物结构进行了深入研究。对乌贼墨多糖的研究表明，其多糖部分主要是由等摩尔比的葡萄糖醛酸(GlcUA)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和岩藻糖(Fuc)构成的一种全新结构的类糖胺聚糖。该多糖结构特异，含有等比例的酸性糖、碱性糖和六碳甲基糖组成的三糖线性重复单元，中国海洋大学的研究人员也从鱿鱼墨中分离得到类似的但具有分支结构的非硫酸酯化的类糖胺聚糖[―3)-β-GlcA (I — 4)-a-GalNAc (I — 3)-a-Fuc (I — ]/?，山东大学从无针乌贼墨中分离得到一种主要由岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和甘露糖(Man)组成的杂多糖。这些头足动物来源的杂多糖作为一种天然生物活性物质，能够抑制突变，显著促进机体的粒系造血机能，抑制S180肉瘤生长，增强小鼠的特异性免疫和非特异性免疫功能，调节机体血脂代谢，提高机体抗氧化能力。可缓解环磷酰胺所致大鼠骨髓造血功能抑制作用乌贼墨多糖对环磷酰胺所致的免疫系统及抗氧化能力损伤具有显著的拮抗作用和促进其快速恢复的功效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能增加脾脏指数、造血功能并且对不良反应有抑制作用的海洋硫酸酯化糖胺聚糖及其相应的具有提取、纯化工艺较简单，提取纯度好、易于操作的制备方法。本专利技术为解决上述问题所采取的技术方案为:一种海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3，其单糖组分含有甘露糖:葡萄糖胺:葡萄糖醛酸:乙酰氨基半乳糖:半乳糖:岩藻糖的质量比例为1:1.5:0.92:3:1.8:2 ;该海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的分子量为IOkDa至16kDa，硫酸基团的含量为10%至14%之间。本专利技术为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为:一种海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的制备方法，其包括以下步骤: 1)乌贼墨多糖的提取:取新鲜乌贼墨囊中乌贼墨浓缩后冻干后，采用酶解法处理后，沉淀烘干，再重新溶解后 使用截留分子量为3500的透析袋对蒸馏水进行透析脱盐和除去小分子物质，得到乌贼墨多糖； 2)分离纯化:采用离子交换层析柱依次采用0.05mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液三个梯度浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集0.01至0.1 mol/L,0.1至0.5 mol/L、0.2至I mol/L的NaCl溶液洗脱，并收集0.2至I mol/L的NaCl溶液洗脱产物；洗脱产物分子量为IOkDa至16kDa。梯度洗脱的截留相对分子质量为3500，流速为0.5至3 mL/min。酶解法为两步酶解法，具体为按料液质量体积比1:10至1:30加入蒸馏水，40°C下磁力搅拌2 h，使墨汁均匀分散后首先采用木瓜蛋白酶提取3 h，加酶量2%，提取温度60°C，pH 7，接着采用胰蛋白酶水解3 h，提取温度60°C，pH 10，加酶量0.5%。提取完后调pH至中性后100°C水浴加热15 min灭酶。最后调节pH至弱酸性，静置使黑色素沉淀后6000 rpm离心15 min,取上清调节pH至中性后浓缩至原体积的1/20，使用终浓度为80%的乙醇进行沉淀。与现有技术相比，本专利技术的优点在于:提取、纯化工艺较简单，提取纯度好、易于操作，增加脾脏指数、造血功能活性显著，安全无毒，对不良反应有抑制作用。【附图说明】图1是本专利技术实施例乌贼墨多糖Q sepharose Fast Flow梯度洗脱硫酸苯酹检测图，其中横轴为接收试管数，纵向轴是490nm吸光度； 图2是本专利技术实施例SE-3的PMP柱前衍生液相色谱图，其中横轴为洗脱时间(min)，纵向轴是245nm吸光度(mAU)； 图3是本专利技术实施例单糖标准品的PMP柱前衍生液相色谱图，，其中横轴为洗脱时间(min)，纵向轴是245nm吸光度(mAU)； 图4是本专利技术实施例分子量标准曲线，其中保留时间为横坐标，分子量对数值为纵坐标； 图5是本专利技术实施例SE-3的高效凝胶色谱图，其中纵轴为单位折光率，保留时间为横坐标。【具体实施方式】以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例:参照图1至图5，本专利技术所涉及的乌贼墨来源于舟山附近海域的金乌贼(Sepia esculenta Hoyle)。本专利技术的新颖硫酸化类糖胺聚糖就是一金乌贼墨为原料制备得到，其制备和结构鉴定包括以下步骤: (I)乌贼墨多糖的提取: 乌贼墨存在于乌贼墨消化道末端的墨囊中，为黑色固体悬浮颗粒。取新鲜乌贼墨囊中乌贼墨浓缩后冻干备用。采用两步酶解法提取乌贼墨多糖。具体为按料液比1:20(质量体积比)加入蒸馏水，40°C下磁力搅拌2 h，本文档来自技高网...

【技术保护点】
海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE‑3，其特征在于该海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE‑3单糖组分含有甘露糖：葡萄糖胺：葡萄糖醛酸：乙酰氨基半乳糖：半乳糖：岩藻糖的质量比例为1:1.5:0.92:3:1.8:2；该海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE‑3的分子量为10kDa至16kDa，硫酸基团的含量为10%至14%之间。

【技术特征摘要】
1.海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3，其特征在于该海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3单糖组分含有甘露糖:葡萄糖胺:葡萄糖醛酸:乙酰氨基半乳糖:半乳糖:岩藻糖的质量比例为.1:1.5:0.92:3:1.8:2 ;该海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的分子量为IOkDa至16kDa，硫酸基团的含量为10%至14%之间。2.根据权利要求1所述的海洋硫酸酯化糖胺聚糖SE-3的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)乌贼墨多糖的提取:取新鲜乌贼墨囊中乌贼墨浓缩后冻干后，采用酶解法处理后，沉淀烘干，再重新溶解后使用截留分子量为3500的透析袋对蒸馏水进行透析脱盐和除去小分子物质，得到乌贼墨多糖； 2)分离纯化:采用离子交换层析柱依次采用0.05mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液三个梯度浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集0.01至0.1 mol/L,0.1至0.5 mol/L、.0.2至1 mol/L的NaCl溶液洗脱，并收集所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈荫，李佩佩，王斌，牛庆凤，李涛，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33