一种高纯度仿刺参糖胺聚糖及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种高纯度仿刺参糖胺聚糖及其制备方法和应用，它的结构式如下：其骨架结构为→4GlcUAβ1→3GalNAcβ1→（m=80~98），其乙酰氨基半乳糖的O-4/6位为硫酸基取代，每个二糖重复结构都含有一个岩藻糖支链（R）。岩藻糖支链有三个取代位置，其中，47.4%的支链连接在葡萄糖醛酸的O-3位，43.8%和8.9%的支链连接在乙酰氨基半乳糖的O-4和O-6位。55.2%岩藻糖支链为O-2,4-双硫酸基取代结构，27.1%为O-3,4-双硫酸基取代，17.7%为O-4单硫酸基取代。硫酸基含量为33.00%~34.00%，重均分子量为90.89±9.12KDa，分子量分布为1.48±0.05，纯度大于99%。本发明专利技术的药物能显著促进小鼠树突状细胞的功能，增强腹腔巨噬细胞能力；促进淋巴细胞增殖，提高体液免疫功能；还能够显著促进造血功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫促进剂药物领域，尤其涉及一种高纯度仿刺参糖胺聚糖及其制备方法和应用。
技术介绍
海参糖胺聚糖是近几十年来从棘皮动物海参体壁细胞及结缔组织中提取得到的一类结构新颖的岩藻糖化的糖胺聚糖。它具有类似硫酸软骨素的主链结构，以及其它糖胺聚糖类聚合物所没有的高度硫酸化的岩藻糖支链。目前，研究较为详细的海参糖胺聚糖主要有两种，分别来源于日本刺参（S.japonicus）和巴西海参（L.grisea）。它们都是有葡萄糖醛酸、乙酰氨基半乳糖、岩藻糖和硫酸基组成。其主链结构均由等摩尔的葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖组成的二糖重复单元，支链结构为硫酸酯化的岩藻糖。但是它们的的结构有许多不同，日本刺参糖胺聚糖的岩藻糖支链以2,4-双硫酸基取代，3,4-双硫酸基取代为主，而巴西海参糖胺聚糖以4-单硫酸基取代为主，少数为2,4-双硫酸基取代，3,4-双硫酸基取代。此外，它们的岩藻糖支链在二糖重复单元的链接位点也不尽相同，巴西海参糖胺聚糖的岩藻糖支链主要连接在糖链非还原端的葡萄糖醛酸的O-3位，而日本刺参的岩藻糖支链以2:6:1:1的比例连接在糖链葡萄糖醛酸的O-3位、乙酰氨基半乳糖的O-4位、O-6位、O-4和O-6位。而中国产仿刺参（Apostichopusjaponicus）与日本刺参属于同一种属，但是他们的生长环境各不相同，生物体内的活性物质的结构也有区别。本专利技术利用核磁、气质等技术对仿刺参糖胺聚糖的结构进行解析，发现其岩藻糖支链主要为2,4-双硫酸基取代和3,4-双硫酸基取代，在二糖重复单元上以4.6:4.5:0.9的比例分布在糖链葡萄糖醛酸的O-3位、乙酰氨基半乳糖的O-4位、O-6位。此结构的海参糖胺聚糖未见有报道。研究表明，海参糖胺聚糖具有明显的抗凝血和血栓形成的活性，并且还能对抗多种实验动物肿瘤的生长及转移，促进机体免疫调节功能。能够增加患病小鼠的免疫器官如脾脏、胸腺的肿瘤；刺激树突状细胞的增殖和分化，提高免疫应答的水平。是一种前景广大的免疫调节剂。仿刺参（Apostichopusjaponicus）属楯手目（Aspidochirotida）刺参科（Stichopodidae）仿刺参属（Apostichopus），是食用海参中质量最好、营养价值最高的一种。产自于渤海和黄海海域的仿刺参，商业价值很高，来源广泛，人工养殖产量丰富，是大量制备仿刺参糖胺聚糖的重要资源。但是，关于中国产仿刺参糖胺聚糖的精细结构的解析以及其在免疫调节和抗肿瘤方面的应用却少见报道。这极大的限制了仿刺参糖胺聚糖的药理学的研究，为阐明海参糖胺聚糖的作用机制设置了障碍，对实现海参糖胺聚糖的药用价值产生了不利的影响。例如，专利CN102993327A和CN103044564A分别利用酶解法和离子交换色谱法对黑海参和玉足海参糖胺聚糖进行了提取分离，却未能阐明糖胺聚糖的具体结构及构效关系，存在一定的缺陷。因此，针对海参糖胺聚糖的生物活性优势、提取分离技术上的问题和结构分析方面的缺失，建立一种行之有效的获得高纯度、低分子量分布、结构明确的海参糖胺聚糖的方法，对发现其抗肿瘤和免疫调节及其他药用价值，提高其生物利用度具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术针对传统提取方法效率低下，得到的海参糖胺聚糖纯度不高、分子量不确定、结构难以明确，以及海参糖胺聚糖在提高免疫力中发挥的作用不详等问题，建立了一种制备高纯度、分子量确定的仿刺参糖胺聚糖（AJ-GAG）的方法，并对其结构进行了明确的表征。此外，对仿刺参糖胺聚糖提高免疫细胞如突树状细胞(DC)、巨噬细胞（Mφ）的活性，增强机体体液免疫活性，修复由于化疗药物诱导的小鼠造血功能损伤等作用进行了研究。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案予以实现：一种结构新颖的仿刺参糖胺聚糖，它的结构式如下：。它的分子骨架结构为→4GlcUAβ1→3GalNAcβ1→二糖重复结构（m=80~98），其乙酰氨基半乳糖的O-4/6位有硫酸基取代，每个二糖重复结构都含有一个岩藻糖支链（R）。岩藻糖支链有三个取代位置，其中，47.4%的支链连接在葡萄糖醛酸的O-3位，43.8%和8.9%的支链连接在乙酰氨基半乳糖的O-4和O-6位。仿刺参糖胺聚糖的岩藻糖支链（R）是高度硫酸化的，结构如结构式中所示，其中，55.2%为O-2,4-双硫酸基取代结构，27.1%为O-3,4-双硫酸基取代结构，17.7%为O-4单硫酸基取代。仿刺参糖胺聚糖的硫酸基含量:33.00%~34.00%。优选地，所述仿刺参糖胺聚糖的重均分子量（Mw）为90.89±9.12KDa，分子量分布宽度为1.48±0.05，纯度大于99%。本专利技术还提供了所述仿刺参糖胺聚糖的制备方法，它包括以下步骤：新鲜的仿刺参(Apostichopusjaponicus)，开肚去水，体壁组织捣碎制成匀浆，配成浓度为40%~60%（M/V）的水溶液，向所述水溶液中加入氢氧化钾至浓度为0.8~1.2mol/L，在50~70℃下搅拌反应0.5~1.5小时，反应终止后冷却。2.用冰醋酸调pH值至8~9，加入0.3%~0.6%（M/V）的胰蛋白酶（EC3.4.21.4），在40~60℃下搅拌反应2~4小时，反应终止后冷却。使用冰醋酸调pH值至6~8，离心去除沉淀。3.上清液加入等体积的95%的乙醇，在4℃下静置过夜，离心收集沉淀物，用80%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤，烘干，得到粗多糖。4.上述粗多糖配成浓度为4%~6%（M/V）的水溶液，离心去除沉淀，向上清液中加入1.5~2.5mol/L的乙酸钾，4℃下静置过夜。5.离心收集沉淀部分，上述沉淀配成浓度为8%~12%（M/V）的水溶液，用1mol/L的氢氧化钾溶液调pH值至9～10，滴加浓度为30%的过氧化氢溶液，40℃~50℃下反应2~3小时至溶液为浅黄色为止，放冷，离心去除不溶物。6.上清液冷至4℃左右，以浓盐酸调pH值至1~2，离心去除沉淀。上清液加入1~2mol/L的乙酸钾，4℃下静置过夜，离心收集沉淀部分。7.上述沉淀配成浓度为15%~25%（M/V）的水溶液，滴加浓度为20%（M/V）的三氯乙酸溶液至沉淀完全，4℃下静置过夜，离心去除沉淀；8.上清液用1mol/L的氢氧化钾溶液调pH值至6~7，用截留分子量为3kDa的透析袋透析36小时。透析液浓缩，冷冻干燥，得到的精制仿刺参糖胺聚糖。优选地，所述仿刺参糖胺聚糖为白色无定型粉末，无嗅无味。优选地，所述仿刺参糖胺聚糖的旋光度[α]D=-56.6°±0.35°。优选地，所述仿刺参糖胺聚糖用醋酸纤维薄膜电泳检测得到单一谱带。优选地，所述仿刺参糖胺聚糖的葡萄糖醛酸、乙酰氨基半乳糖、岩藻糖和硫酸基的摩尔比值为0.97：1.00：1.13：3.85。优选地，所述仿刺参糖胺聚糖的蛋白和核酸检测，A280nm≤0.15，A260nm≤0.200。优选地，所述仿刺参糖胺聚糖的制备中的残留溶剂醋酸和乙醇限量均小于0.5%。利用本专利技术的制备方法可以得到一种纯度极高、分子量确定、高阴离子强度的糖胺聚糖，即硫酸岩藻糖化的硫酸软骨素。在相关的提取工艺中，采用了碱提法和酶提法相结合的方法，在保证糖胺聚糖结构不被破坏的前提下，去除蛋白、核酸等杂质。并利用高浓度的乙酸钾与糖胺聚糖形成水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结构明确的高纯度仿刺参糖胺聚糖，其特征在于它的结构通式为：它的分子骨架结构为→4GlcUAβ1→3GalNAcβ1→二糖重复结构（m=80~98），其乙酰氨基半乳糖的O‑4/6位有硫酸基取代，每个二糖重复结构都含有一个岩藻糖支链（R），岩藻糖支链有三个取代位置，其中，47.4%的支链连接在葡萄糖醛酸的O‑3位，43.8%和8.9%的支链连接在乙酰氨基半乳糖的O‑4和O‑6位，仿刺参糖胺聚糖的岩藻糖支链（R）是高度硫酸化的，结构如结构式中所示，其中，55.2%为O‑2,4‑双硫酸基取代结构，27.1%为O‑3,4‑双硫酸基取代结构，17.7%为O‑4单硫酸基取代。

【技术特征摘要】
1.一种结构明确的高纯度仿刺参糖胺聚糖，其特征在于它的结构通式为：它的分子骨架结构为→4GlcUAβ1→3GalNAcβ1→二糖重复结构（m=80~98），其乙酰氨基半乳糖的O-4/6位有硫酸基取代，每个二糖重复结构都含有一个岩藻糖支链（R），岩藻糖支链有三个取代位置，其中，47.4%的支链连接在葡萄糖醛酸的O-3位，43.8%和8.9%的支链连接在乙酰氨基半乳糖的O-4和O-6位，仿刺参糖胺聚糖的岩藻糖支链（R）是高度硫酸化的，结构如结构式中所示，其中，55.2%为O-2,4-双硫酸基取代结构，27.1%为O-3,4-双硫酸基取代结构，17.7%为O-4单硫酸基取代。2.根据权利要求1所述的一种高纯度仿刺参糖胺聚糖，其特征在于：硫酸基含量为33.00%~34.00%。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：吕志华，王远红，杨洁，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37