人类口腔粘膜干细胞分泌蛋白质组制造技术

本发明专利技术提供了源自人类口腔粘膜干细胞(hOMSC)的分泌蛋白质组(secretome)以及包含hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物。还提供了用于获得、操纵hOMSC源性分泌蛋白质组的方法以及在疗法、美容和组织再生中使用hOMSC源性分泌蛋白质组的方法。

Proteome secreted by human oral mucosa stem cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人类口腔粘膜干细胞分泌蛋白质组专利
本专利技术属于干细胞和再生医学领域。特别地，本专利技术提供了源自人类口腔粘膜干细胞的分泌蛋白质组(secretome)的组合物。还提供了用于获得、操纵干细胞分泌蛋白质组的方法以及在疗法中使用干细胞分泌蛋白质组的方法。专利技术背景人口腔粘膜源性干细胞(hOMSC)是源自口腔粘膜的固有层的独特干细胞群(Marynka-Kalmani等2010)。hOMSC表达由胚胎干细胞、神经嵴干细胞和间充质干细胞的标志物组成的独特免疫表型。全基因分析鉴定出，hOMSC从体内向体外的转移引起在哺乳动物生物体的胚胎和胎儿发育阶段期间参与神经嵴细胞谱系的发育的基因的差异表达。神经嵴是一种短暂的发育结构，产生外胚层和间充质起源的多种细胞谱系，分别包括神经元谱系和胶质细胞谱系以及成软骨细胞谱系、成骨细胞谱系、脂肪细胞谱系和成纤维细胞谱系。还已经显示出hOMSC在体外和体内分化成这些细胞谱系(Marynka-Kalmani等2010、Treves-Manushevitz等2013、Ganz等2014a、2014b)。发现分化为多巴胺能样神经元细胞或星形胶质细胞样细胞并且移植在体内的hOMSC在动物模型中具有治疗作用(Ganz等2014a、2014b)。此外，显示出具有一定治疗活性的幼稚hOMSC(hOMSC)甚至在这些动物模型中无效，它们的治疗作用与安慰剂的治疗作用相似。最近，已经显示出胚胎干细胞和成体干细胞也是细胞外囊泡的一个延伸来源(Desrochers等2016、Konala等2016)。细胞外囊泡(EV)是由真核细胞的细胞质释放的大小范围从50nm至1.5微米-2微米的囊泡。EV按照其生物发生和大小主要分为2个主要类别：具有50nm-1500nm的大小范围的微囊泡或脱落微囊泡；和具有30nm-120nm的大小范围的外泌体(exosome)。外泌体是源自多泡体的腔膜的脂双层膜囊泡，其通过与细胞膜融合组成性释放。微囊泡和外泌体的生物发生是不同的。微囊泡通过出芽和从膜分裂在质膜处形成。外泌体源自内体和高尔基体系统并且至少部分通过转运所需要的内体分选复合物植根于细胞表面，在细胞表面它们经历胞吐作用。细胞外囊泡包含含有蛋白、脂质、核酸的货物(cargo)(Desrochers等2016、Xu等2016)。取决于细胞的起源、它的生理和病理状态以及细胞释放部位，EV内容物是异质的并且处于动态状态中。由于货物被选择性地分选到外泌体中，外泌体的组成可以与它们起源的细胞不同。除了经典的细胞-细胞接触方式和用于旁分泌和自分泌作用的可溶性因子的分泌之外，已经显示出EV的货物用作用于细胞-细胞通讯的一种方法。关于EV生物作用的大多数知识源自对癌细胞完成的工作。体外和体内已经显示出，EV的货物诱导癌细胞增殖和存活和血管生成以及肿瘤成纤维细胞迁移、存活和生长(Antonyak等2015)。外泌体已经被证明是遗传物质的载体并且被推荐为用于癌症诊断和预后的生物标志物并且被提出用于监测治疗效力。目前，基于外泌体递送肿瘤疫苗和药物被评价为用于癌症的治疗策略(Gue等,2017)。发现来自源自骨髓和脂肪组织的成体干细胞的条件培养基在心脏缺血中和伤口愈合中具有治疗潜力(Lai等2010、Hu等2016)。存在越来越多的证据证明，微囊泡和外泌体之间的货物的内容物有差异并且该差异受细胞的起源控制(Kanada等2015)。此外，最近的数据指示，货物的性质对由多种类型的癌细胞释放的EV和对由不同类型的干细胞释放的那些EV二者是细胞特异性的(Villarroya-Beltri等2014、Lopez-VerrilliMA等2016)。WO2008/132722公开了胃肠道的粘膜并且特别是口腔粘膜的固有层作为多能成体干细胞(pluripotentadultstemcell)的来源。WO2013076726公开了源自口腔粘膜的固有层的干细胞(OMSC)作为用于选择性分化成不同神经谱系的来源，以及它们在诱导或保存神经发生中的以及用于神经退行性和精神紊乱的疗法的以及在由于创伤引起的神经组织损失中的用途。US2016/0256496涉及牙龈成纤维细胞源性产物例如条件培养基，及其在用于预防或治疗骨科病理诸如骨关节炎和类风湿性关节炎的方法中的用途。MedCellLtd.的WO/2017/001649、WO/2016/082882和WO/2016/083500公开了产生由间充质干细胞或树突状细胞分泌的分泌蛋白质组的特定方法。WO/2014/057097公开了一种用于通过在适当的培养基中共培养成体人类间充质干细胞和成体完全分化心肌细胞以获得预处理的(preconditioned)成体人类间充质干细胞来调节成体人类间充质干细胞的分泌蛋白质组的方法。仍然存在对可用于预防和治疗疾病和紊乱以及促进组织再生的组合物的未满足的需求。这样的组合物可以有益地源自独特、可扩增和容易可及的来源。专利技术概述源自口腔粘膜的固有层的人类干细胞(hOMSC)的条件培养基或分泌蛋白质组现在被公开作为治疗性组合物。本专利技术部分基于以下发现：幼稚hOMSC分泌蛋白质组的组合物是独特的并且因此具有独特的治疗潜力，其优于源自其他来源的幼稚干细胞的分泌蛋白质组。此外，hOMSC刺激可能引起反映为分泌蛋白质组内容物的变化并且因此反映为它的治疗能力的细胞应答。还设想了从所述hOMSC刺激得到的分泌蛋白质组对hOMSC刺激的细胞是独特的，并且如果应用到由其他来源衍生的成体干细胞，相同的刺激将导致不同的分泌蛋白质组。本文首次公开了幼稚hOMSC的分泌蛋白质组具有在存在、不存在或相对量的细胞因子、趋化因子和核酸方面与其他干细胞的分泌蛋白质组不同的独特特征。本文还公开了hOMSC和包含源自其的分泌蛋白质组的无细胞组合物能够促进糖尿病伤口愈合，表明hOMSC分泌蛋白质组在促进新血管系统、细胞增殖和结缔组织形成中的潜在用途。出乎意料地，hOMSC及其在伤口愈合中的分泌蛋白质组活性优于源自其他来源的干细胞和分泌蛋白质组。根据本专利技术的源自可及的、可再生的和可消耗的幼稚hOMSC细胞来源的分泌蛋白质组易于获得和使用，而不需要诱导细胞的分化。根据一个方面，本专利技术提供了一种无细胞组合物，所述无细胞组合物包含由人类口腔粘膜干细胞分泌的物质(hOMSC源性分泌蛋白质组)连同至少一种载体、赋形剂或稀释剂。包含根据本专利技术的hOMSC源性分泌蛋白质组的无细胞组合物在它们的内容物方面是独特的并且与其他来源的干细胞的分泌蛋白质组不同。根据一些实施方案，hOMSC是幼稚的。根据一些实施方案，无细胞组合物包含：(i)来自由以下组成的组的至少一种蛋白：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C(CST3)、半乳凝素-1(LGALS1)、胶质细胞源性连接蛋白(SERPINE2)、胰岛素样生长因子II本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无细胞组合物，所述无细胞组合物包含由人类口腔粘膜干细胞分泌的物质(hOMSC源性分泌蛋白质组)连同至少一种载体、赋形剂或稀释剂。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170716 US 62/533,0561.一种无细胞组合物，所述无细胞组合物包含由人类口腔粘膜干细胞分泌的物质(hOMSC源性分泌蛋白质组)连同至少一种载体、赋形剂或稀释剂。


2.如权利要求1所述的无细胞组合物，所述无细胞组合物包含：
(i)来自由以下组成的组的至少一种蛋白：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C(CST3)、半乳凝素-1(LGALS1)、胶质细胞源性连接蛋白(SERPINE2)、胰岛素样生长因子II(IGF2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白1(LTBP1)、潜伏转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)、潜伏转化生长因子β结合蛋白3片段(LTBP3)、潜伏转化生长因子β结合蛋白4(LTBP4)、神经母细胞分化相关蛋白(AHNAK)和色素上皮源性因子(SERPINF1/PEDF)；或
(ii)选自由以下组成的组的至少一种蛋白：肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、巨噬细胞炎性蛋白-3(MIP-3a)、生长调节性癌基因-α(GRO-a或CXCL1)、巨噬细胞源性/CCL22趋化因子(MDC或CCL22)、生长调节性癌基因(GRO)、IGFBP-2、神经营养因子-4(NT-4)、单核细胞趋化蛋白2(MCP-2/CCL8)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-2(IL-2)和脑源性神经营养因子(BDNF)；或
(iii)选自由以下组成的组的至少一种蛋白：
1SV，3SV，ACTG2，ADAM10，ADAMTSL1，ADM，ANXA4，APOD，CALM2，CD109，CD59，CDH6，CFD，COL15A1，COL1A2，COLEC12，CTHRC1，CTSC，CTSL，CXCL12，DCD，DDAH2，DKK1，DSG1，DSP，DSTN，ECH1，EDIL3，EFEMP1，ELN，FLG，GNB2，GREM2，H3F3B，HBA1，HIST1H2AH，HIST1H2BK，HIST1H4A，HMGN2，HNRNPAB，HSP90AA1，HSPA1A，HSPG2，IGFBP5，JUP，KHSRP，LDHA，MNB2，LTBP4，MAN1A1，MFAP4，MMP1，MMP14，MT2A，NBL1，OMD，PFN1，PI16，PSG5，PSMB6，PTGDS，RARRES2，SLIT3，SPOCK1，SPTBN4，STOM，TMSB10，TMSB4X，TNFAIP6，TNXB，TPI1，TUBA1C，UBC，VIT
和WNT5A；或
(iv)选自由以下组成的组的至少一种微小RNA(miRNA)：
hsa-miR-4454+hsa-miR-7975，hsa-miR-23a-3p，hsa-let-7b-5p，hsa-miR-612，hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-3144-3p，hsa-miR-199a-3p+hsa-miR-199b-3p，hsa-miR-191-5p，hsa-miR-100-5p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-1260a，hsa-miR-378h，hsa-miR-379-5p，hsa-miR-376a-3p，hsa-let-7i-5phsa-miR-526a+hsa-miR-518c-5p+hsa-miR-518d-5p，hsa-miR-212-3p，hsa-miR-520c-3p，hsa-miR-28-5p，hsa-miR-758-3p+hsa-miR-411-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-1206，hsa-miR-1286，hsa-miR-514a-3p，hsa-miR-548ah-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-543，hsa-miR-626，hsa-miR-339-3p，hsa-miR-1234-3p，hsa-miR-155-5p，hsa-miR-888-5p，hsa-miR-542-3p，hsa-miR-514b-5p，hsa-miR-548m，hsa-miR-30e-5p和hsa-miR-1290；
或其组合。


3.如权利要求2所述的无细胞组合物，所述无细胞组合物包含来自(i)、(ii)、(iii)或(iv)的多于一种物质。


4.如权利要求2所述的无细胞组合物，所述无细胞组合物包含来自(i)的至少一种蛋白、来自(ii)的至少一种蛋白、(iii)中的至少一种蛋白以及任选地来自(iv)的至少一种miRNA。


5.如权利要求1至4中任一项所述的无细胞组合物，所述无细胞组合物包含选自由以下组成的组的至少一种因子：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和血管内皮生长因子(VEGF)。


6.如权利要求1至4中任一项所述的无细胞组合物，所述无细胞组合物包含选自由以下组成的组的至少六种微小RNA：hsa-miR-4454+hsa-miR-7975，hsa-miR-23a-3p，hsa-let-7b-5p，hsa-miR-612，hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-3144-3p，hsa-miR-199a-3p+hsa-miR-199b-3p，hsa-miR-191-5p，hsa-miR-100-5p，hsa-miR-127-3p，hsa-miR-1260a，hsa-miR-378h，hsa-miR-379-5p，hsa-miR-376a-3p，hsa-let-7i-5p，hsa-miR-526a+hsa-miR-518c-5p+hsa-miR-518d-5p，hsa-miR-212-3p，hsa-miR-520c-3p，hsa-miR-28-5p，hsa-miR-758-3p+hsa-miR-411-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-1206，hsa-miR-1286，hsa-miR-514a-3p，hsa-miR-548ah-5p，hsa-miR-184，hsa-miR-543，hsa-miR-626，hsa-miR-339-3p，hsa-miR-1234-3p，hsa-miR-155-5p，hsa-miR-888-5p，hsa-miR-542-3p，hsa-miR-514b-5p，hsa-miR-548m，hsa-miR-30e-5p和hsa-miR-1290。


7.如权利要求2至5中任一项所述的无细胞组合物，其中(i)、(ii)或(iii)中的至少一种蛋白比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中的浓度显著更高的浓度存在。


8.如权利要求7所述的无细胞组合物，其中比源自其他干细胞来源的分泌蛋白质组中的浓度显著更高的浓度存在的所述至少一种蛋白选自由以下组成的组：基质细胞源性因子1(CXCL12/SDF1，P48061)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD1，P00441)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF，P55145)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PIGF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和血管内皮生长因子(VEGF)。


9.如权利要求1至8中任一项所述的无细胞组合物，所述无...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑杜·皮塔鲁，
申请(专利权)人：雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL