利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，该方法包括步骤：1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面；2)去除基质胶，向细胞培养皿中加入无饲养层培养基，接种人多能干细胞，进行人多能干细胞的培养传代；3)细胞达到40～50％汇合度时，去除无饲养层培养基，加入含细胞因子的基础培养基，进行人多能干细胞的培养分化；4)收集细胞置于Transwell培养装置中，制作类肾器官。本发明专利技术还提供了按照上述方法制备得到的多细胞类肾器官。这种类肾器官由内皮与肾间质包绕完整分段的肾单位组成，而且其转录与人胚肾相似。

【技术实现步骤摘要】
利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法
本专利技术是关于一种类肾器官的培养方法，具体地说，是关于一种利用人诱导多能干细胞(hiPSCs)构建类肾器官的方法。
技术介绍
干细胞是能够分化为多种细胞类型的细胞。人诱导多能干细胞(hiPSCs)可以分化为多种细胞类型，现在已经可以直接分化形成脑、心、肠、肝、肺、肾等类器官。尽管在构建组织特异性单位与类器官方面已经取得显著成果，但在体外保存这种细胞聚集体仍是个巨大挑战。细胞培养需要氧气与养分，但体外构建的3D类器官缺乏血管系统，所以其寿命、大小和成熟度通常受限制。人类的肾脏包含多达200万个负责血液滤过的上皮肾单位。为了满足排泄和PH值、电解质及体液平衡的调节等功能，再生肾脏需要诱导20多种不同的细胞类型。目前，尚未有在体外利用人多能干细胞构建类肾器官的相关技术报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种体外构建类肾器官的技术。一方面，本专利技术提供了一种利用人诱导多能干细胞(hiPSCs)构建类肾器官的培养方法，其是在体外利用人多能干细胞构建类肾器官。具体而言，本专利技术的方法包括以下步骤：1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面；2)去除基质胶，向细胞培养皿中加入无饲养层培养基，接种人多能干细胞，进行人多能干细胞的培养传代；3)细胞达到40～50％汇合度时定为第0天，去除无饲养层培养基，加入含细胞因子的基础培养基(STEMdiffAPELMedium)，进行人多能干细胞的培养分化；4)收集细胞置于Transwell过滤器表面，制作类肾器官。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤1)中，是用移液枪吸取所述的基质胶，移入细胞培养皿中，晃动摇匀，使基质胶均匀分布覆盖于培养皿底部，然后将基质胶覆盖的细胞培养皿在37℃下放置3～6小时或在2～8℃放置过夜，放置期间基质胶需始终保持完全覆盖皿底。具体地，以6孔板的1个孔为例，通常情况下，吸取1ml的基质胶即可均匀分布覆盖于培养皿底部。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤1)中，所述基质胶为BasementMembraneMatrix或hESCqualifiedMatrigel。所述基质胶可商购获得，例如可购自北京赛贝生物技术有限公司、InVitroTechnologies等。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤2)中，所述的无饲养层培养基为完全培养基。例如，可以是PSC-Easy完全培养基，具体地，其包括以下组分：基础培养基DMEM/F-12；添加剂：碳酸氢钠543μg/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素生长因子20ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人乳铁蛋白11μg/ml、抗坏血酸65μg/ml以及重组人转化生长因子2ng/mL。所述完全培养基可商购获得，例如可购自北京赛贝生物技术有限公司等。通常情况下，以6孔板的1个孔为例，可加入1～2ml的无饲养层培养基。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，所述的人多能干细胞包括人诱导多能干细胞(hiPSCs)。诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPScells)最初是日本科学家山中伸弥(ShinyaYamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为多能干细胞，对于这类干细胞称之为诱导多能干细胞。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤2)中，人多能干细胞接种前经过以下处理步骤：根据需要进行解冻；或已经在连续的培养之中的人多能干细胞不需要解冻；使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面的过程可以按照如下操作进行：以连续培养之中的细胞为例：用移液枪吸取trypsinEDTA(0.25％)(吸取量以6孔板的1个孔为例通常为1ml)，移入细胞培养皿中，在37℃下放置约3min。然后吸去trypsinEDTA，尽量吸尽，但注意不要把白色细胞克隆吸起。之后用移液枪吸取无饲养层培养基(吸取量以6孔板的1个孔为例通常为1ml)，移入细胞培养皿中，吹打细胞，吹打的动作轻柔、速度缓慢，总次数少于10次，即得到脱离原培养表面的人多能干细胞，可进一步将其接种于所述的细胞培养皿表面。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，在将人多能干细胞接种于所述的细胞培养皿表面时，可以按照如下操作进行：将人多能干细胞按照1:8至1:10的比例接种到新培养皿中，水平十字摇匀。显微镜下确认大部分细胞团块大小为4～20个细胞，细胞密度为10～20％。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，以连续培养之中的细胞为例，传代接种的前提条件优选为：显微镜下观察旧培养皿中的细胞状态良好，细胞汇合度80～90％。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤2)中，人多能干细胞培养温度为36℃～37.5℃，每天更换所述的无饲养层培养基1次，4天传代一次。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，人多能干细胞传代培养达到40～50％汇合度时定为第0天，去除无饲养层培养基。更具体地，本专利技术中，每一代细胞都是在细胞长至80～90％汇合度时进行传代，按照1:8至1:10的比例传代，在新培养皿中，传代后的子代细胞均是10～20％汇合度，2～3天后即可长至40～50％汇合度。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，去除无饲养层培养基时，采用移液枪直接吸除，尽量吸尽，弃掉即可。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤3)中所述的含细胞因子的基础培养基，第0天使用的是含8μMCHIR99021的基础培养基，第2天更换一次含8μMCHIR99021的基础培养基，第4天使用的是含有200ng/mlFGF9+1μg/ml肝素的基础培养基，每2天更换培养基(含有200ng/mlFGF9+1μg/ml肝素的基础培养基)。该过程中，培养温度始终保持在36℃～37.5℃。每次更换培养基时，培养基用量约为1～2ml(以6孔板的1个孔为例)。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤4)中所述的步骤是人多能干细胞培养第7天进行。收集细胞置于Transwell过滤器表面的的具体操作包括以下步骤：(4-1)使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面，收集细胞；(4-2)使用不含细胞因子的基础培养基重悬细胞，进行细胞计数并离心，在Transwell培养装置的下室中加入含5μMCHIR99021的基础培养基，将离心后的细胞球体置于Transwell上室(Tra本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，该方法包括步骤：1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面；2)去除基质胶，向细胞培养皿中加入无饲养层培养基，接种人多能干细胞，进行人多能干细胞的培养传代；3)细胞达到40～50％汇合度时，去除无饲养层培养基，加入含细胞因子的基础培养基，进行人多能干细胞的培养分化；4)收集细胞置于Transwell培养装置中，制作类肾器官。

【技术特征摘要】
1.一种体外利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，该方法包括步骤：1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面；2)去除基质胶，向细胞培养皿中加入无饲养层培养基，接种人多能干细胞，进行人多能干细胞的培养传代；3)细胞达到40～50％汇合度时，去除无饲养层培养基，加入含细胞因子的基础培养基，进行人多能干细胞的培养分化；4)收集细胞置于Transwell培养装置中，制作类肾器官。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中是用移液枪吸取所述的基质胶，移入细胞培养皿中，晃动摇匀，使基质胶均匀分布覆盖于培养皿底部，然后将基质胶覆盖的细胞培养皿在37℃下放置3～6小时或在2～8℃放置过夜，放置期间基质胶需始终保持完全覆盖皿底。3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中所述基质胶为BasementMembraneMatrix或hESCqualifiedMatrigel。4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中所述的无饲养层培养基为完全培养基。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的人多能干细胞包括人诱导多能干细胞。6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中人多能干细胞接种前经过以下处理步骤：解冻；或者，已经在连续的培养之中的人多能干细胞不需要解冻；使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面。7.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖枫林，李清刚，陈香美，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11